长链非编码RNA OTUD6B-AS1、微RNA-365a-3p在肝癌中表达与临床病理特征及预后的关系

宋奇锋，高良辉，林师佈，张译中，沈立

作者单位：海南医学院第一附属医院肝胆外科，海南 海口570100

肝癌是在全球范围内最常见的致命恶性肿瘤，而在所有的肝癌病人中，超过90%为肝细胞癌［1］。尽管近年来由于治疗方法的改进有效地降低了肝癌的发病率，但肝癌病人的长期预后仍不理想［2］。因此，探索有效的生物标志物对于改善肝癌的预后具有重要意义。长链非编码RNA（LncRNA）位于细胞核或细胞质中，长度超过200个核苷酸。虽然LncRNA不具备蛋白质编码能力，但它们在表观遗传学和调节基因表达方面具有重要作用［3］。已证实LncRNA参与脑发育、胚胎发育、组织学分化和器官发生，且已有大量研究表明LncRNA还参与了癌症中许多复杂的细胞过程［4］。例如，LncRNA人去泛素化酶含有卵巢肿瘤结构域的6B反义RNA1（OTUD6B-AS1）被证实在肝癌中高表达［5］，然而，其在肝癌预后中的作用仍不清楚。微RNA（miRNA）是基因表达过程中重要调节因子，参与调控癌细胞增殖、转移、侵袭等过程，其在癌症中功能已得到普遍认可。miR-365a-3p在多种类型癌症中具有抑癌作用，已有研究表明miR-365a-3p能够通过靶向抑制E2F2表达，从而抑制肝癌细胞增殖［6］；且另有研究认为，miR-365a-3p可作为肝细胞癌的预后生物标志物［7］。本研究通过Starbase数据库预测得出miR-365a-3p可能与LncRNA OTUD6B-AS1存在靶向关系。于是，在本研究中首先对肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p的表达进行检测，进而评估了其表达与预后的相关性，以期为肝癌病人做出最佳的临床治疗决策提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2015年3月至2017年3月海南医学院第一附属医院收治的肝癌病人86例（肝癌病人组），和同期体检的健康志愿者86例（健康对照组）。其中肝癌病人组男性54例，女性32例，年龄（55.32±5.38）岁。健康对照组男性48例，女性38例，年龄（54.25±4.86）岁。两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。另外，收集整理肝癌病人肿瘤长径、TNM分期等临床病理特征资料。

纳入标准：①符合《原发性肝癌诊疗规范（2017年版）》［8］中诊断标准；②具备手术指征，行手术切除，术后经病理确诊为肝细胞癌；③病人入组前未接受过靶向治疗等相关治疗项目；④病人或其近亲属在充分了解研究目的和过程后签署知情同意书；⑤临床资料均完整，且获得长期随访。排除标准：①合并其他肿瘤；②患有肾脏疾病；③入院前感染；④合并严重的心脑功能障碍；⑤不愿配合后续研究；⑥有免疫缺陷。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 血清及组织样品收集 采集所有研究对象的外周血（5 mL），静置30 min，然后在3 000 r/min和25 ℃下离心10 min，收集血清用于后续检测。收集术中切除的肝癌组织及对应的癌旁组织，立即置于液氮中，随后放置在-80 ℃贮存。

1.3 血清及组织中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达检测 RNA分离试剂盒（15596018，美国Invitrogen）从血清样本及组织样本中提取总RNA。按照TransScript Green两步qRT-PCR Super-Mix试剂盒（AQ201-01，北京TransGen Biotech）说明书进行逆转录，并在StepOne™ Real-Time PCR系统（美国Applied Biosystems）上进行LncRNA OTUD6BAS1、miR-365a-3p表达检测。以β-actin或U6为内参使用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 生物信息学分析 使用Starbase数据库对LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p之间的靶向关系进行分析。

1.5 随访 随访5年，采用电话、微信随访，来院复查形式进行定期随访，获取疾病情况及生存资料，随访截止2022年4月30日，记录术后5年累积生存时间，即术后第1天至死亡时间。

1.6 统计学方法 本研究采用SPSS 22.0进行数据分析。GraphPad prism7用于绘制图像。计数资料以例（%）表示，组件比较采用χ2检验；符合正态分布的计量资料以表示，两组间比较为独立样本t检验或配对t检验。Pearson分析血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达的相关性。以Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并通过log-rank检验比较生存率差异。Cox回归模型分析肝癌病人预后的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清及组织中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达水平比较 肝癌病人组血清LncRNA OTUD6B-AS1表达水平高于健康对照组，miR-365a-3p表达水平低于健康对照组（P＜0.05），见表2。

表2 两组血清LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达水平比较/

表2 两组血清LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达水平比较/

组别健康对照组肝癌病人组t值P值例数86 86 LncRNA OTUD6B-AS1 1.02±0.32 1.59±0.41 10.16＜0.001 miR-365a-3p 1.05±0.26 0.42±0.15 19.46＜0.001

肝癌组织LncRNA OTUD6B-AS1表达水平高于对应的癌旁组织，miR-365a-3p表达水平低于对应的癌旁组织（P＜0.05），见表3。

表3 肝癌病人肝组织LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达水平比较/

表3 肝癌病人肝组织LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达水平比较/

组别癌旁组织肝癌组织t值P值例数86 86 LncRNA OTUD6B-AS1 0.97±0.16 1.70±0.44 14.46＜0.001 miR-365a-3p 1.01±0.14 0.53±0.17 20.21＜0.001

2.2 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达与临床病理特征的相关性 以肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达水平中位数（1.57、0.43）为界限，其中LncRNA OTUD6B-AS1表达水平＞1.57的病人为LncRNA OTUD6B-AS1高表达组（n=43），≤1.57的病人为LncRNA OTUD6B-AS1低表达组（n=43），miR-365a-3p表达水平＞0.43的病人为miR-365a-3p高表达组（n=43），≤0.43的病人为miR-365a-3p低表达组（n=43）。结果显示，肝癌病人血清LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达水平与TNM分期、淋巴结转移、分化程度有关（P＜0.05），与性别、年龄、肿瘤长径、乙肝病毒、血管侵犯无关（P＞0.05）。见表4。

表4 肝癌病人86例血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达与临床病理特征的相关性/例（%）

2.3 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达的相关性分析 经Starbase数据库预测发现，LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p之间存在靶向结合位点，经Pearson相关性分析显示，肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达呈现负相关（r=-0.47，P＜0.05）。见图1。

图1 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达的相关性

2.4 肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达与预后的相关性 所有病人随访5年，死亡64例，86例肝癌病人的生存率为25.58%（22/86）。LncRNA OTUD6B-AS1低表达组生存率37.21%（16/43）高于LncRNA OTUD6B-AS1高表达组13.95%（6/43）（χ2=6.11，P=0.013）；miR-365a-3p高表达组生存率41.86%（18/43）高于miR-365a-3p低表达组9.30%（4/43）（χ2=8.03，P=0.005）。

以预后（死亡=1，存活=0）为自变量，将单因素分析有差异因素为自变量，多因素Cox回归分析显示，LncRNA OTUD6B-AS1高表达以及miR-365a-3p低表达是影响肝癌病人死亡的独立危险因素（P＜0.05）。见表5。

表5 Cox回归分析影响肝癌86例预后的影响因素

3 讨论

肝癌是全球最常见的胃肠道恶性肿瘤，好发于过度饮酒、感染肝炎病毒、肝硬化等人群，近年来发病率和死亡率呈明显的上升趋势，危害大［9］。由于早期肝癌的临床症状比较隐蔽，诊断时病情常较严重，即可能已发展至中期，甚至是晚期，临床治疗效果不好。且早发现、早治疗的肝癌病人较中晚期病人生存时间长。因此，探讨能辅助评估肝癌病人预后的指标至关重要。

LncRNA是长度超过200 nt非编码RNA，在表观遗传变化、转录调控和转录后修饰中发挥作用［10］，通过对miRNA和靶蛋白的靶向调控，参与各种疾病的发生和发展。已有研究表明LncRNA参与并调控肿瘤细胞增殖、迁移、上皮间质转化等过程，与肝癌等多种恶性肿瘤有关［11］。LncRNA OTUD6BAS1也是LnRNA中的一员，近期张小博等［5］报道也证明LncRNA OTUD6B-AS1可促进肝癌细胞发展。另有学者发现，LncRNA OTUD6B-AS1在肝癌组织中高表达，通过miR-664b-3p调节GSKIP/Wnt/β-catenin信号传导增强肝癌细胞增殖和侵袭［12］。本研究结果显示，LncRNA OTUD6B-AS1在肝癌病人血清及肝癌组织中高表达，与既往报道一致［12］，且与肝癌病人的TNM分期、淋巴结转移以及分化程度有关，说明LncRNA OTUD6B-AS1表达升高可能参与肝癌发生及病情恶性进展，其机制可能与LncRNA OTUD6B-AS1能靶向调控肝癌病理机制中关键基因进而调控信号转导有关。

miRNA作为一种新型生物标志物，在癌细胞的细胞周期、分化和细胞凋亡中发挥着至关重要的作用［13］。大量研究表明，miR-365a-3p在多种人类癌症中充当肿瘤抑制因子，如Yang等［14］表明miR-365a-3p过表达可诱导胃癌细胞周期停滞在G1期，显著抑制细胞增殖；黄君华等［15］研究显示，miR-365a-3p与三阴性乳腺癌的不良进展相关，可通过调节JAKSTAT通路抑制肿瘤恶性进展。但miR-365a-3p在肝癌中的作用尚不清楚，因此，本研究检测了血清及肝癌组织中miR-365a-3p表达情况，结果显示，肝癌病人血清及肝癌组织中miR-365a-3p表达降低，说明miR-365a-3p可能与肝癌的发生有关，且血清与癌组织中miR-365a-3p表达具有一致性。进一步研究发现，miR-365a-3p表达与肝癌病人TNM分期、淋巴结转移、分化程度有关，提示miR-365a-3p可能参与并影响肝癌发展过程，其可能在肝癌发病过程中发挥抑癌基因作用。本研究还发现，LncRNA OTUD6B-AS1高表达与miR-365a-3p低表达肝癌病人具有更低的5年累积生存率，且LncRNA OTUD6B-AS1高表达及miR-365a-3p低表达均为肝癌病人预后不良独立危险因素，提示LncRNAOTUD6B-AS1与miR-365a-3p可作为评估肝癌预后的标志物。另外，通过Starbase数据库分析发现，LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p存在结合位点，相关性分析也证实肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达水平呈明显负相关，说明二者可能共同参与肝癌发生发展。

综上所述，肝癌病人血清及肝癌组织中LncRNA OTUD6B-AS1表达上调，miR-365a-3p表达下调，与TNM分期、淋巴结转移、分化程度有关，二者的异常表达可作为肝癌病人的预后评估标志物。然而，本研究仍存在不足之处，肝癌病人中乙肝病毒感染率较高，可能影响LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p检测水平的准确性；LncRNA OTUD6BAS1、miR-365a-3p参与肝癌的具体调控机制还需深入探究。