基于网络药理学的头花蓼中槲皮素、没食子酸和槲皮苷对幽门螺杆菌胃炎以及胃癌治疗机制研究

宋孝晗，张姝，，黄健，莫非，

作者单位：1贵州医科大学医学检验学院临床检验学教研室，贵州 贵阳550004；2贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州 贵阳550004

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是一种革兰阴性微需氧的螺旋形细菌，通常定植于胃和十二指肠黏膜［1］。研究表明，H.pylori与慢性胃炎密切相关，其引起的胃黏膜组织炎症损伤经久不愈，可引起胃癌的发生［2］。现如今，胃癌已成为威胁人类健康的重要疾病之一，全球胃癌数据显示，其发病率排名第五，死亡率排名第三［3］。幽门螺杆菌相关性疾病的治疗一直是临床上的一大难题，尤其是胃癌，西医治疗主要以外科手术为主，结合辅助放化疗等综合措施，但存在明显不良反应［4］。针对幽门螺杆菌相关性疾病，首要任务是抑菌，现阶段临床上应用较广的治疗方案是质子泵抑制剂（和铋剂）联合两种抗生素构成的三联或四联疗法，然而，抗生素的广泛使用使H.pylori耐药率增强，导致其根除率逐年下降。因此，寻求安全有效且注重整体调节的新型药物对幽门螺杆菌胃炎以及胃癌的临床防治具有重大意义。

头花蓼作为中药现代化重点培育发展的“十大中药产业链”和“十大苗药”品种之一，具有清热利湿、解毒止痛、活血化瘀等独特疗效［5］。我们前期的研究表明头花蓼能够显著抑制H.pylori在胃黏膜的定植率，可有效改善H.pylori引起的胃黏膜的炎症反应，并能显著抑制胃癌相关因子的表达情况［6-7］。然而由于多成分组合的作用机制研究较为复杂，头花蓼发挥药理作用的机制研究较少，因此需进一步深入研究并完善。

网络药理学是一种融合了系统生物学和药理学的思想，从整体的角度去探索药物与疾病间的关联性，同时运用计算机技术对药物、蛋白、基因等生物化学信息进行构架、模拟和分析，从传统寻找单一靶点转向综合网络分析的新兴学科。目前，网络药理学已被广泛应用于中药复方优化、新药开发、中药活性成分筛选等方面，为复杂的中药研究提供了新的方法［8］。因此，本课题通过网络药理学的分析方法，分析中药成分-靶点-疾病之间的相互作用关系，进一步阐释头花蓼的药理学机制，为头花蓼对幽门螺杆菌胃炎以及胃癌的治疗提供一定的理论基础与科学依据。

1 材料与方法

1.1 基于网络药理学的分析及工作流程 本研究使用了一种基于网络药理学的方法来研究头花蓼中槲皮素、没食子酸和槲皮苷对幽门螺杆菌胃炎以及胃癌治疗机制（图1）。具体而言，首先对头花蓼中3种化合物的预测靶点及幽门螺杆菌胃炎以及胃癌相关的疾病差异表达基因进行收集，紧接着通过交集分析获取关键靶点。利用DAVID数据库对相关靶点进行GO和KEGG的富集分析，并应用AutoDock软件进行分子对接，以分析hub基因与其对应小分子的结合能。从而展示头花蓼中槲皮素、没食子酸和槲皮苷对幽门螺杆菌胃炎以及胃癌治疗机制。

1.2 确定头花蓼中主要活性化合物可能的靶点在本课题组前期的研究中，通过高效液相色谱（HPLC）检测，从中分离出3个主要成分：槲皮素、没食子酸和槲皮苷［6］。从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获得头花蓼这三种化合物的化学结构，之后使用STITCH（http：//stitch.embl.de/）、SEA（http：//sea.bkslab.org）、SwissTarget-Prediction（http：//swisstargetprediction.ch/）、SymMap（http：//www.symmap.org/）数据库检索各化合物靶点，并用SwissTargetPrediction数据库分别分析这三种化合物靶点的功能。

1.3 疾病差异表达基因的分析 利用Gene Cards（http：//www.genecards.org/）数据库检索获取由H.pylori引起的胃炎及胃癌相关差异表达基因，筛选其中得分较高的部分。同时从GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下载微阵列数据集GSE581，获取健康人和H.pylori感染病人，以及健康人和H.pylori感染导致的胃癌病人的差异表达基因。

1.4 PPI网络的构建及分析 使用Veen图分析头花蓼的预测靶点与H.pylori相关性胃炎及胃癌差异表达基因之间的相互作用。利用STRING（https：//string-db.org/）分析头花蓼潜在作用靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）关系，随后应用Cytoscape进行网络可视化，并用R脚本计算hub基因。

1.5 GO和KEGG富集分析 将目标基因上传至DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库中，以Homo Sapiens为研究对象，对潜在作用靶点进行 GO（gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，以确定所涉及的靶基因的生物学过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和KEGG富集通路。

1.6 分子对接 从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载三种化合物的XML格式文件，通过OpenBable软件将其转换成PDB格式文件。使用PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）下载头花蓼对幽门螺杆菌胃炎以及胃癌治疗过程中核心靶点的PDB格式文件。利用分子对接模拟软件AutoDock对三种化合物和蛋白靶点进行对接模拟计算，结合能小于0说明配体与受体可以自发结合，结合能≤-5.0 kJ/mol证明分子与靶点对接较好。

2 结果

2.1 头花蓼主要化学成分的靶点预测 从Pub-Chem数据库中获得这三种化合物的化学结构。使用STITCH、SEA、SwissTargetPrediction、SymMap数据库来预测靶点，分别获取224、109、61个预测靶点。SwissTargetPrediction根据其生化指标对靶基因的功能进行分类，这些靶基因主要包括激酶、酶、裂解酶等，见图2。

2.2 幽门螺杆菌胃炎及胃癌差异表达基因的鉴定 在基因表达数据集GSE581中，根据P＜0.05和|log FC|＞1作为筛选疾病基因的截止值，分别获取98、225个胃炎和胃癌的差异表达基因。之后从Gene Cards数据库中根据relevance score＞10为筛选标准，分别获取83、809个胃炎和胃癌的差异表达基因。综合上述两个数据库的分析结果，去除重复值，共获取178、974个胃炎和胃癌的差异表达基因。

2.3 头花蓼对幽门螺杆菌胃炎及胃癌作用靶点的预测及相互作用分析 将头花蓼主要活性化合物对应的310个预测靶点和178、974个胃炎和胃癌的差异表达基因进行分析，并以Venn图形式进行可视化处理，共获得27个头花蓼和胃炎的交集靶点及107个头花蓼和胃癌的交集靶点。其中TP53、MET、EGFR、ERBB2、BCL2L1等27个基因可能在幽门螺杆菌胃炎以及胃癌的整个过程中均起作用，见图3。

将交集靶点导入STRING数据库，设置置信度＞0.400，对这27个基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。并进一步导入Cytoscape软件进行网络拓扑学分析，条形图显示了hub基因连接数（degree值），degree值最多的基因，如 TP53、CASP3、PTGS2、IL6、JUN和CXCL8，可能在头花蓼处理过程中起到关键作用，见图4。

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路分析 利用David数据库对头花蓼有效作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路分析，共获得43个生物过程（biological process，BP）、6个细胞组分（cellular component，CC）和16个分子功能（molecular function，MF）。这些基因富集显著的GO功能主要为炎症反应（inflammatory response）、受体复合物（receptor complex）、蛋白质异二聚体活性（protein heterodimerization activity）。另外，获得55条KEGG富集通路，如细胞凋亡（Apoptosis）、TNF信号通路等（TNF signaling pathway），见图5。

2.5 分子对接 使用Cytoscape构建头花蓼-三种活性化合物-靶基因的网络图，获取各化合物和其预测靶点的相互对应关系。其中槲皮素的预测靶点为TP53、CASP3、IL6、JUN、CXCL8；没食子酸的预测靶点为TP53、CASP3、JUN；槲皮苷的预测靶点为CASP3、PTGS2。对degree值前6（degree值＞21）的核心靶点和其相对应的化合物分子使用 AutoDock 软件进行分子对接，分子与靶点蛋白的最低结合能均小于0，说明配体与受体均可以自发结合，80%结合能小于-5 kJ/mol，则意味着其对接较好，其中 TP53蛋白与槲皮素的对接结合能小于-5 kJ/mol，结合能为-6.75 kJ/mol；CASP3蛋白与槲皮素、没食子酸、槲皮苷结合能均小于-5 kJ/mol，结合能分别为-6.36、-6.35、-9.36 kJ/mol；PTGS2蛋白与槲皮苷的对接结合能小于-5 kJ/mol，结合能为-10.66 kJ/mol；IL-6蛋白与槲皮素的对接结合能小于-5 kJ/mol，结合能为-7.31 kJ/mol；JUN蛋白与槲皮素结合能小于-5 kJ/mol，结合能为-6.35 kJ/mol；CXCL8蛋白与槲皮素的对接结合能小于-5 kJ/mol，结合能为-7.83 kJ/mol，见图6，表1。

表1 头花蓼中核心化合物的分子对接

图6 头花蓼-三种活性化合物-靶基因的网络图

使用pymol软件对对接结果进行绘图，由图可见，TP53与槲皮素分别在PHE328，ASN345，GLU326处形成氢键，与没食子酸分别在ILE332、ARG335、GLY334处形成氢键；CASP3与槲皮素分别在TYR276、MET39、ASP40处形成氢键，与没食子酸分别在LYS271、LYS38、SER112、GLY153处形成氢键，与槲皮苷分别在SER205、SER63、ARG207、TQ81176处形成氢键，见图7。

图7 头花蓼中核心化合物的分子对接模式图

3 讨论

H.pylori是一种高感染率且具有致病性的常见细菌，能够破坏胃上皮细胞的完整性，突破胃黏膜屏障，黏附并定植于胃上皮细胞，引起机体免疫系统的失衡和炎症反应，并可通过释放反应性氧即氧化应激进一步损伤胃黏膜，长期感染后可使胃黏膜出现肠上皮化生和不典型增生，最终引起癌变。我国是H.pylori感染的重灾区，其引起的胃癌是我国发病率和死亡率均居第二位的恶性肿瘤［9］，且抗生素的广泛使用使H.pylori的耐药率逐年攀升，这使得寻求新的抗H.pylori突破口成为一个亟待解决的问题。头花蓼作为一种传统的药用植物，因其具有抗菌、抗炎、镇痛、降温和抗氧化活性等疗效而被广泛使用［5］。我们前期研究结果发现头花蓼对于H.pylori感染性疾病具有良好的疗效，其既可抑制细菌生长代谢，又能够调整机体内环境，提高机体对细菌的抵抗能力［6］。

本研究借助网络药理学的方法系统性地对头花蓼中3种有效化合物治疗幽门螺杆菌胃炎以及胃癌的作用机制进行了探讨。根据头花蓼三种有效化合物对幽门螺杆菌相关性胃炎及胃癌作用靶点的预测及相互作用分析的结果，筛选出头花蓼在幽门螺杆菌胃炎以及胃癌的整个过程中均发挥作用的27个作用靶点。为了进一步了解这些基因的功能，对其进行了PPI分析和功能富集分析。结果表明在头花蓼的作用过程中，一些hub基因，如TP53、CASP3、PTGS2、IL6、JUN和CXCL8发挥着重要作用。其中IL6、JUN和CXCL8是炎症相关因子，是H.pylori引起的炎症反应中的关键基因［10-12］；TP53、CASP3和PTGS2则与癌症的发生发展密切相关。根据网络分析结果，对degree值前6的核心靶点和其相对应的化合物分子使用 AutoDock 软件进行分子对接，结果表明分子与靶点蛋白的最低结合能均小于0，说明配体与受体均可以自发结合，且80%的最低结合能≤-5.0 kJ/mol，进一步证实了本研究前期预测的准确性。肿瘤抑制基因P53（TP53）位于17号染色体，是一种重要的抑癌基因，在细胞的衰老、凋亡、分化及代谢过程中具有重要作用。有研究称TP53基因72号密码子的多态性，与人类胃癌的发生发展密切相关［13］。周展新等［14］发现TP53在胃癌及其淋巴结转移癌组织中呈现高表达，其表达与胃癌的分化程度、肿瘤的TNM分期及淋巴结转移呈正相关。CASP3在细胞凋亡过程中发挥着重要作用，吴静洁等［15］称，柚皮素可以与CASP3结合，并阻滞细胞周期、诱发细胞程序性死亡，能发挥抗肿瘤以及抑制新生血管形成的作用。在本研究中，头花蓼中的槲皮素、没食子酸和槲皮苷均与CASP3对接较好，且槲皮素、没食子酸也能够和TP53自发结合，这些结果提示TP53和CASP3可能是头花蓼作用于幽门螺杆菌胃炎以及胃癌的重要靶点。除此之外，炎症反应、受体复合物、蛋白质异二聚体活性、细胞凋亡信号通路、TNF信号通路等也参与了头花蓼的治疗过程。

综上所述，本研究通过网络药理学证实了头花蓼三种有效化合物在治疗幽门螺杆菌胃炎以及胃癌过程中有显著优势，具有多靶点、多途径的特点，头花蓼可能通过TP53和CASP3在治疗幽门螺杆菌胃炎以及胃癌过程发挥作用。这些发现表明头花蓼可能成为治疗幽门螺杆菌胃炎以及胃癌的候选药物，为幽门螺杆菌胃炎以及胃癌的治疗和头花蓼老药新用提供了新的依据。