中心体相关蛋白55、睾丸表达基因14在结直肠癌组织中表达及其临床意义

郭洁，田春阳，夏永欣

作者单位：南阳市中心医院消化内科，河南 南阳473000

结直肠癌是临床位居第三的常见恶性肿瘤，近年来由于人们生活方式及饮食习惯的改变，结直肠癌的发病率呈上升趋势［1-2］。虽然医疗技术在不断提高，但对于结直肠癌病人5年生存率并没有太大改善，而影响结直肠癌病人预后的主要原因是复发和转移［3-4］。因此，寻找影响疾病发生与发展的指标对于改善病人预后，减少复发和转移有重要意义。中心体相关蛋白55（centrosome-associated protein 55，CEP55）是卷曲螺旋蛋白家族成员，能够起到调控细胞周期的作用［5］。研究显示CEP55 mRNA和蛋白表达在食管鳞状细胞癌中明显升高，CEP55高表达病人较CEP55低表达病人预后更差［6］。睾丸表达基因14（testis expressed gene 14，TEX14）是在睾丸中鉴定表达的一个基因，其高表达与侵袭转移性乳腺癌病人的不良预后有关［7］。但CEP55、TEX14在结直肠癌中的作用及与病人预后的关系尚不清楚。因此，本研究通过检测结直肠癌组织和癌旁组织中CEP55、TEX14 mRNA和蛋白表达情况，分析与病人临床病理特征和预后的关系，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年10月至2016年10月在南阳市中心医院行手术治疗的78例结直肠癌病人癌组织和对应癌旁组织作为研究对象。病人男40例，女38例；年龄范围为40～80岁，年龄（62.33±7.92）岁；有淋巴结转移30例，无淋巴结转移48例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期50例；肿瘤长径（2.92±1.60）cm；分化类型：高分化26例，中分化30例，低分化22例。纳入标准：①经病理学诊断确诊为结直肠癌病人；②未接受过放化疗者；③临床资料完整，病人或其近亲属知情同意。排除标准：①伴有免疫系统疾病者；②合并其他部位肿瘤者；③合并其他消化道疾病者。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 数据库分析 利用Ualcan数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）分析CEP55和TEX14在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况。

1.2.2 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法检测CEP55和TEX14 mRNA表达 按照Trizol试剂盒（深圳辉诺生物科技有限公司）中的方法提取结直肠癌组织和癌旁组织中总RNA，并按照反转录试剂盒（上海博尔森生物科技有限公司）中的方法反转录为cDNA。CEP55和TEX14 mRNA均以β-action作为内参进行分析，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，见表1。反应条件为95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40个循环。计算Ct值，并根据公式2-ΔΔCt对CEP55和TEX14 mRNA进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 免疫组化染色法检测CEP55和TEX14蛋白表达 将术中切除的结直肠癌组织和癌旁组织使用10%甲醛固定，常规石蜡包埋后连续切成5 μm片状。以下步骤严格按照试剂说明书进行，经过脱蜡和水化后，进行微波煮沸将抗原修复，滴入封闭液，分别加入CEP55和TEX14蛋白第一抗体（1∶200稀释），在4 ℃下孵育过夜，经PBS冲洗，之后加入生物素标记的第二抗体（1∶100稀释），在37 ℃下孵育30 min，PBS缓冲液冲洗，DAB染色，显色后用自来水冲洗终止反应，苏木精复染，自来水冲洗反蓝，二甲苯脱水，中性树胶封片。在光学显微镜下选取5个视野观察染色情况和阳性细胞占比。用CEP55和TEX14蛋白的阳性病理切片做阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.4 判定结果 由病理科两位医生使用双盲法在显微镜下观察各张染色切片结果，并对其进行评分。CEP55与TEX14蛋白阳性表达均主要为细胞质出现棕黄色均匀颗粒。①根据阳性细胞显色强度进行评分。0分为无着色；1分为淡黄色染色；2分为棕黄色染色；3分为棕褐色染色。②根据阳性细胞着色百分比进行评分。阳性细胞占比0～5%记0分；阳性细胞占比＞5%～25%记1分；阳性细胞占比＞25%～50%记2分；阳性细胞占比＞50%～75%记3分；阳性细胞占比＞75%记4分。综合评分=阳性细胞显色强度×阳性细胞着色所占百分比，综合评分≤3分表达为阴性，综合评分＞3分表达为阳性［8］。

1.3 随访观察 对所有结直肠癌病人进行为期5年的随访，采用门诊复查及电话随访的方式，截至2021年10月31日，其中第1年3个月随访1次，第2～3年6个月随访1次，第4～5年1年随访1次，分析不同CEP55和TEX14蛋白的表达情况与结直肠癌病人生存率的关系。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0分析数据。计量资料以表示，行配对样本t检验；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。不同CEP55和TEX14蛋白表达与结直肠癌病人生存率的关系以Kaplan-Meier法进行分析，行log-rank检验；影响结直肠癌病人预后的因素以Cox回归模型进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ualcan数据库分析结果 Ualcan数据库分析结果显示，结直肠癌组织中CEP55和TEX14表达量均明显高于癌旁组织（P＜0.05）。见图1。

图1 Ualcan数据库结直肠癌组织中CEP55和TEX14表达分析结果：A为CEP55表达；B为TEX14表达

2.2 CEP55和TEX14 mRNA在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况 qRT-PCR结果显示，结直肠癌组织中CEP55和TEX14 mRNA水平均明显高于癌旁组织（P＜0.05）。见表2。

表2 CEP55和TEX14 mRNA在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况/

表2 CEP55和TEX14 mRNA在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况/

组别结直肠癌组织癌旁组织t值P值例数78 78 CEP55 mRNA 2.34±0.70 1.00±0.26 15.34＜0.001 TEX14 mRNA 1.57±0.44 0.98±0.25 10.42＜0.001

2.3 CEP55和TEX14蛋白在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况 免疫组化结果显示，CEP55和TEX14蛋白在结直肠癌组织中阳性表达主要位于细胞质，见图2。CEP55和TEX14蛋白在结肠癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织中CEP55和TEX14蛋白的阳性表达率（P＜0.05）。见表3。

图2 CEP55和TEX14蛋白在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达（免疫组化染色×400）：A为结直肠癌组织中CEP55；B为癌旁组织中CEP55；C为结直肠癌组织中TEX14；D为癌旁组织中TEX14

表3 CEP55和TEX14蛋白在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况/例（%）

2.4 结直肠癌组织中CEP55和TEX14蛋白表达与病人临床病理特征的关系 CEP55和TEX14蛋白表达与病人性别、年龄、部位、病理类型、肿瘤长径、肿瘤形态无关（P＞0.05），与分化类型、有无淋巴结转移、TNM分期、有无神经浸润、有无肝转移有关（P＜0.05）。见表4。

2.5 CEP55和TEX14蛋白表达与结直肠癌病人5年生存率的关系 结直肠癌组织中CEP55蛋白阳性病人生存率为52.73%（29/55），明显低于CEP55蛋白阴性病人生存率78.26%（18/23）（χ2=4.44，P=0.035）；TEX14蛋白阳性病人生存率为52.63%（30/57），明显低于TEX14蛋白阴性病人生存率80.95%（17/21）（χ2=5.43，P=0.020）。

2.6 影响结直肠癌病人5年预后的因素分析 低分化、淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、CEP55蛋白阳性、TEX14蛋白阳性是影响结直肠癌病人5年预后的独立危险因素（P＜0.05）。见表5。

3 讨论

结直肠癌的发病机制尚不明确，饮食及生活习惯的改变可促进结直肠癌的发生与发展［9-10］。目前，结直肠癌的治疗措施有手术、放化疗及靶向治疗等，但对预后的改变并不理想［11-12］。这主要与结直肠癌晚期发生侵袭和转移密切相关［13］。因此寻找与结直肠癌侵袭、转移相关的生物标志物，可能对提高病人生存率有帮助。

CEP55是一种调节蛋白，参与着纺锤体的装配，具有调节细胞周期的作用［14］。李志强等［15］对124例宫颈癌病人进行研究，发现CEP55在宫颈癌组织中呈高表达状态，且随着临床分期，疾病的恶化，其高表达率逐渐上升。Lin等［16］研究报道，CEP55在结直肠癌组织和肿瘤细胞中均上调。本研究对78例结直肠癌病人进行研究，结果显示，结直肠癌组织中CEP55 mRNA水平和蛋白表达阳性率均明显高于癌旁组织，与Lin等［16］结果基本一致，且与本研究Ualcan数据库分析结果一致，提示CEP55可能参与结直肠癌发病。进一步分析结直肠癌病人病理特征，发现有淋巴结转移及肝转移、低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有神经浸润病人CEP55蛋白表达阳性率升高，提示CEP55蛋白阳性表达与结直肠癌的进展密切相关。Wu等［17］研究报道，肺腺癌组织中CEP55表达水平较相邻正常组织高，且CEP55表达与肺腺癌病人预后独立相关。Huang等［18］研究表明，与CEP55低表达的有淋巴结转移的晚期结直肠癌病人相比，CEP55高表达病人具有更低的5年生存率。本研究对结直肠癌病人进行5年生存分析，发现CEP55蛋白阳性病人5年生存率明显低于CEP55蛋白阴性病人，与Huang等［18］结果类似，提示CEP55表达水平可能与结直肠癌病人预后相关。

TEX14基因位于染色体17q22，含有35个外显子，在细胞有丝分裂中发挥着重要作用［19］。TEX14是一种无活性的激酶，在生殖细胞中充当CEP55的内源性抑制剂，以阻止细胞脱落，从而形成合胞体［20］。毕乙超等［7］研究结果显示，TEX14在乳腺癌中呈高表达，并且可促进乳腺癌转移。本研究Ualcan数据库分析结果显示，结直肠癌组织中TEX14表达量明显高于癌旁组织，且通过qRT-PCR和免疫组化检测，结果发现结直肠癌组织中TEX14 mRNA水平及蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织，与毕乙超等［7］研究类似，提示高水平的TEX14可能与结直肠癌发生有关。进一步研究发现，TEX14蛋白表达与分化类型、有无淋巴结转移、TNM分期、有无神经浸润、有无肝转移有关，提示TEX14可能促进结直肠癌病人病情进展。生存分析结果显示，TEX14蛋白阴性病人具有较高的5年生存率，提示TEX14表达与结直肠癌病人预后有一定关系。此外，本研究进行了Cox回归模型分析，结果显示低分化、淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、CEP55蛋白阳性、TEX14蛋白阳性是影响结直肠癌病人5年预后的独立危险因素，提示临床除需关注结直肠癌病人常见预后指标外，还需关注CEP55、TEX14表达对预后的影响。

综上所述，CEP55和TEX14在结直肠癌组织中呈高表达，且CEP55和TEX14蛋白阳性病人5年生存率低于阴性病人，有望成为预测结直肠癌病人预后的有效指标。但由于本研究样本量较少，对于CEP55和TEX14表达是否受其他因素影响，需要进一步研究。