微RNA-582-5p与音猬因子在结直肠癌病理诊断和预后评估中的价值

孙志涛，姜辉，张宝玉，高晶晶，肖伟，周国庆，宋东旭，张亚玲，马红艳

作者单位：沧州市人民医院，a胃肠外科，b肛肠外科，c神经外科，d病理科，河北 沧州061000

结直肠癌是常见消化道恶性肿瘤，发病率与病死率在我国呈上升趋势，由于其具有侵袭性，易发生转移，多数病人确诊时已到局部晚期或远处转移，治疗效果不理想，病人预后较差，晚期病人的5年生存率较低，因此，对结直肠癌的早期诊断及预后评估具有重要意义［1-2］。音猬因子（sonic hedgehog，SHH）是信号通路蛋白，是干细胞自我更新的重要调控蛋白，与肿瘤的发生与恶性进展有关，研究表明，结直肠癌组织中SHH表达明显上调，抑制SHH通路激活可抑制结直肠癌的迁移与侵袭［3-4］。经Targetscan在线预测发现，微RNA-582-5p（miR-582-5p）与SHH存在靶向结合位点，而目前研究发现miR-582-5p在多数肿瘤中呈低表达，如在膀胱癌中，过表达miR-582-5p可抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡［5］。另有研究显示，环状RNA泛素相关蛋白2（circUBAP2）通过调节miR-582-5p/叉头盒蛋白O1（FOXO1）增强自噬并促进结直肠癌进展和转移［6］，故推测miR-582-5p也参与结直肠癌的发生发展。miR-582-5p是否与SHH共同参与结直肠癌的发生发展尚未见报道，本研究检测结直肠癌组织中miR-582-5p与SHH的表达情况，分析miR-582-5p与SHH水平在结直肠癌病人病理诊断和预后评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年6月至2018年12月在沧州市人民医院收治的125例结直肠癌病人作为观察对象，所选病人均取结直肠癌组织及癌旁组织，125例病人中，肿瘤长径＜5 cm 69例，≥5 cm 56例；肿瘤部位为结肠77例，直肠48例；肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期60例；有脉管侵犯51例，无脉管侵犯74例；有淋巴结转移60例，无淋巴结转移65例。另选同期经病理诊断为结直肠息肉的97例病人作为结直肠息肉组。

纳入标准：（1）经病理学检查确诊为结直肠癌；（2）术前未经过抗肿瘤治疗；（3）病人临床资料与随访资料完整；（4）病人或其近亲属知情同意。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤或转移性结直肠癌病人；（2）合并高血压、糖尿病、感染性疾病病人；（3）合并肝肾功能不全者。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。获得所有组织标本一部分-80 ℃冰箱保存，一部分使用4%甲醛溶液固定使用石蜡包埋。

1.2 研究方法

1.2.1 qRT-PCR检测miR-582-5p及SHH mRNA的表达 各组织标本-80 ℃冰箱保存，各标本取50 mg，研磨后加入Trizol试剂（上海，Beyotime）提取总RNA，PrimeScript™ RT Master Mix（日本，Takara）合成cDNA后，采用SYBR Green Master（德国，Roche）进行PCR扩增，各引物引物序列（广州，Ribobio）见表1。反应结束后，分别以U6、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，采用2-ΔΔCt分析法计算miR-582-5p、SHH mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 免疫组织化学染色 各标本经石蜡包埋，连续切片后，使用兔抗人SHH单克隆抗体（上海，Beyotime）（1∶1 000稀释），SupervisionTM二步法免疫组化染色，阴性对照以PBS作为一抗，阳性对照为已知SHH阳性组织切片，由两位资深病理医师双盲诊断。

染色结果判断：SHH阳性表现为黄色颗粒，主要分布于细胞质，阳性细胞数分别为0～10%、＞10%～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%，计为0、1、2、3、4分；细胞染色强度无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别计0、1、2、3分。两项积分相乘≤1分为阴性（-），≥2分为阳性（+）。

1.2.3 miR-582-5p与SHH的靶向验证 结肠癌细胞系HCT116（上海中国科学院细胞库）以每孔5×104个细胞接种在24孔板中，待细胞贴壁生长至约60%时，将构建的pmirGLO双萤光素酶野生型（wt）与突变型（mut）SHH表达载体（Promega公司）分别与miR-582-5p mimics、miR-NC质粒（广州，Ribobio）共转染细胞24 h，每组设置6个复孔，检测各组细胞萤光素酶活性。

1.3 统计学方法 利用SPSS 22.0进行统计学分析，miR-582-5p、SHH mRNA表达水平用表示，两组比较行t检验，多组比较行单因素方差分析；计数资料采用例（%）表示，组间比较采用χ2检验；Pearson分析结直肠癌组织中miR-582-5p与SHH mRNA表达的相关性，Kaplan-Meier曲线分析miR-582-5p、SHH表达与病人预后相关性；受试者操作特征（ROC）曲线分析miR-582-5p、SHH mRNA对结直肠癌的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-582-5p及SHH mRNA表达水平比较qRT-PCR结果显示，在癌旁组织、结直肠息肉组织、结直肠癌组织中miR-582-5p表达水平依次降低（F=521.23，P＜0.001），SHH mRNA表达水平依次升高（F=661.24，P＜0.001），见表2。

表2 miR-582-5p及SHH mRNA表达水平比较/

表2 miR-582-5p及SHH mRNA表达水平比较/

注：miR-582-5p为微RNA-582-5p，SHH为音猬因子。①与癌旁组织比较，P＜0.05。②与结直肠息肉组织比较，P＜0.05。

组别癌旁组织结直肠息肉组织结直肠癌组织F值P值SHH mRNA 1.03±0.12 1.78±0.34①2.47±0.41①②661.24＜0.001例数125 97 125 miR-582-5p 1.05±0.15 0.83±0.12①0.65±0.09①②521.23＜0.001

2.2 SHH蛋白表达水平比较 免疫组织化学染色结果显示，SHH蛋白在结直肠癌组织、结直肠息肉组织、癌旁组织中阳性表达率分别为67.20%（84/125）、34.48%（30/87）、19.20%（24/129），三组之间比较差异有统计学意义（χ2=61.58，P＜0.001），结直肠癌组织、结直肠息肉组织SHH蛋白阳性表达率高于癌旁组织（χ2=6.31，P=0.012；χ2=58.68，P＜0.001），结直肠癌组织SHH蛋白阳性表达率显著高于结直肠息肉组织（χ2=22.09，P＜0.001），见图1，表3。

图1 结直肠癌癌旁组织、结直肠息肉组织、结直肠癌组织SHH蛋白表达（SP×200）:A为癌旁组织SHH阴性表达;B为结直肠息肉组织阳性表达;C为结直肠癌组织SHH阳性表达

表3 音猬因子（SHH）蛋白在三种标本的表达/

表3 音猬因子（SHH）蛋白在三种标本的表达/

注：①与癌旁组织比较，P＜0.05。②与结直肠息肉组织比较，P＜0.05。

阴性/例101 67 41组别癌旁组织结直肠息肉组织结直肠癌组织例数125 97 125阳性/例24 30 84阳性率/%19.20 30.93①67.20①②

2.3 结直肠癌组织中miR-582-5p与SHH mRNA的相关性 Pearson相关性分析显示，结直肠癌组织中miR-582-5p与SHH mRNA表达呈负相关性（r=-0.63，P＜0.05），如图2。

图2 结直肠癌组织中miR-582-5p与SHH mRNA相关性

2.4 miR-582-5p与SHH的靶向验证 如图3所示，经Targetscan在线预测发现，miR-582-5p与SHH存在靶向结合位点。双萤光素酶实验检测结果显示，野生型（wt）SHH表达载体与miR-582-5p mimics共转染HCT116后，与miR-NC比较，相对萤光素活性显著降低（P＜0.05），见表4。

图3 微RNA-582-5p（miR-582-5p）与音猬因子（SHH）的靶向结合位点预测

表4 双萤光素酶活性检测结果/

表4 双萤光素酶活性检测结果/

注：miR-582-5p为微RNA-582-5p，SHH为音猬因子。

组别miR-NC miR-582-5p mimics t值P值SHH-mut 0.98±0.09 1.03±0.10 0.91 0.384 SHH-wt 1.01±0.13 0.37±0.05 11.26＜0.001

2.5 miR-582-5p、SHH与结直肠癌临床病理特征的关系 miR-582-5p在肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有脉管侵犯和有淋巴转移的结直肠癌组织中表达水平低于肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、无脉管侵犯和无淋巴转移的结直肠癌组织（P＜0.05），SHH在肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有脉管侵犯和有淋巴转移的结直肠癌组织中阳性表达率高于肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、无脉管侵犯和无淋巴转移的结直肠癌组织（P＜0.05），见表5。

2.6 miR-582-5p、SHH mRNA对结直肠癌的诊断价值分析 以是否为结直肠癌作为因变量，以结直肠息肉、结直肠癌中miR-582-5p、SHH mRNA表达为自变量，经ROC曲线分析显示，miR-582-5p诊断结直肠癌的AUC为0.82，95%CI：（0.76，0.87），P＜0.05，截断值为0.71，灵敏度为76.00%，特异度为77.32%，SHH mRNA诊断结直肠癌的AUC为0.86，95%CI：（0.81，0.90），P＜0.05，截断值为2.11，灵敏度为80.00%，特异度为79.38%，二者联合诊断结直肠癌的AUC为0.92，95%CI：（0.88，0.95），P＜0.05，灵敏度为86.40%，特异度为85.57%，联合诊断效能高于单独检测（Z=3.00，P=0.002；Z=2.31，P=0.021）。

2.7 miR-582-5p、SHH与结直肠癌病人预后关系根据ROC曲线诊断的截断值，将miR-582-5p表达分为高表达组（≥0.71）与低表达组（＜0.71），Kaplan-Meier曲线分析显示，miR-582-5p低表达和SHH阳性表达病人无进展生存期和总生存期显著低于miR-582-5p高表达（χ2=4.70，P=0.030；χ2=5.43，P=0.020）和SHH阴性表达（χ2=12.72，P＜0.001；χ2=6.51，P=0.010），见图4。

图4 miR-582-5p、SHH与结直肠癌病人预后关系

3 讨论

miRNA可参与调控肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤耐药性等过程，在肿瘤中异常表达，成为肿瘤诊断和预后预测的生物标志物［7］。miR-582-5p与肿瘤的发生密切相关，多项研究［8-10］显示，miR-582-5p在胃癌、肺癌、骨肉瘤等多种肿瘤中明显低表达，过表达miR-582-5p可显著抑制肿瘤细胞增殖与侵袭，发挥抑癌作用。Huang、Dai等［11］研究表明，长链非编码RNA DCST1-AS1通过靶向miR-582-5p表达调控HMGB1蛋白表达，促进结直肠癌细胞的生长与侵袭。本研究结果显示，miR-582-5p在结直肠癌组织中表达水平显著降低，与Huang、Dai等［11］研究结果一致，且miR-582-5p表达显著低于结直肠息肉组织中表达水平，提示miR-582-5p可能与结直肠癌的发生有关，其机制可能与miR-582-5p参与调控肿瘤细胞的增殖有关。研究［12］显示，在非小细胞肺癌中，miR-582-5p的表达在TNM分期较高、伴淋巴结转移病人癌组织中表达水平较低，提示miR-582-5p表达与肿瘤进展有关。本研究结果显示，miR-582-5p在肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有脉管侵犯和有淋巴转移的结直肠癌组织中表达水平显著低于肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、无脉管侵犯和无淋巴转移结直肠癌组织中的表达水平，提示miR-582-5p的低表达与结直肠癌的进展和发生转移有关。研究［10］显示，在骨肉瘤中，与miR-582-5p低表达，过表达miR-582-5通过靶向抑制神经肿瘤腹侧抗原1表达，抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移与侵袭能力。在前列腺癌中过表达miR-582-5p通过抑制TGF-β信号通路抑制前列腺癌骨转移［13］。这些研究表明，miR-582-5p通过调控不同的靶基因或通路影响肿瘤的侵袭与转移，推测其在结直肠癌中的转移与侵袭中发挥重要的调控作用。

SHH信号通路是参与干细胞自我更新调控的重要通路，在调节干细胞增殖、分化、胚胎发育过程中起着重要的作用，此外，SHH信号通路也调控着肿瘤干细胞的自我更新，在维持肿瘤干细胞样特性、肿瘤恶性进展发挥关键作用［14］。多项报道［15-16］显示，多种肿瘤如肝癌、膀胱癌、胰腺癌、结直肠癌等与SHH信号通路异常激活有关。本研究结果显示，结直肠癌组织中SHH mRNA表达水平及蛋白阳性表达率显著升高，且在肿瘤分期较高、有脉管侵犯和有淋巴转移的结直肠癌组织中蛋白阳性表达率更高，与报道一致，研究［17］显示，SHH在结直肠癌中表达上调，且SHH的上调表达在维持结肠癌细胞干性时发挥重要作用。表明在结直肠癌中，存在SHH信号通路激活，而抑制SHH信号通路激活可显著抑制肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭［18］。提示SHH通路在结直肠癌中可能发挥促进肿瘤细胞增殖与迁移，进而促进结直肠癌发生发展的作用。

本研究还发现，结直肠癌组织中miR-582-5p表达水平与SHH mRNA表达呈负相关性，且通过生物信息学软件targetscan预测发现，miR-582-5p与SHH存在靶向结合位点，双萤光素酶报告基因实验结果证实miR-582-5p和SHH存在靶向关系，

推测miR-582-5p可能通过靶向调控SHH表达调控结直肠癌细胞增殖、迁移与侵袭，促进结直肠癌的发生发展。另外，本研究还显示，miR-582-5p、SHH对结直肠息肉、结直肠癌的鉴别诊断有一定临床意义，二者联合诊断结直肠癌的灵敏度与特异度更高，提示miR-582-5p、SHH可能成为结直肠癌病理诊断的标志物。

基因异常表达与肿瘤预后密切相关，研究［19］显示miR-582-5p、SHH表达还与癌症病人预后相关，miR-582-5p的低表达与SHH高表达与病人不良预后有关。本研究显示，miR-582-5p低表达和SHH阳性表达病人的无进展生存期和总生存期显著低于miR-582-5p高表达和SHH阴性表达病人，提示miR-582-5p、SHH与病人预后有关，提示miR-582-5p、SHH可能作为评估结直肠癌预后的标志物，推测其原因为miR-582-5p低表达和SHH阳性表达结直肠癌恶性进展更快，可能发生转移进而影响预后。

综上所述，结直肠癌组织中miR-582-5p低表达、SHH高表达，且与结直肠癌病人临床病理特征和预后有关，可能成为结直肠癌的病理诊断和预后评估的标志物，对临床诊断具有一定价值意义，其具体作用机制需更深入地研究。