基于宏基因组测序的检测技术诊断呼吸道感染性疾病92例

李加雄，李丹，金晓菲，刁振华，卢惠伦，游世伦

作者单位：深圳市龙岗区第二人民医院呼吸内科，广东 深圳518000

感染性疾病是导致人类死亡的关键原因之一，其中呼吸道感染具有发病迅速、病情较重以及并发症较多等特点，是导致感染性疾病病人死亡的首要原因［1］。有研究报道显示，早期准确、快速地识别病原微生物种类是合理应用抗感染药物的重要依据，亦是改善病人预后的重中之重［2］。然而，受病原微生物种类多样性的影响，呼吸道感染性疾病病人的病原体往往不明确，现有的病原学检测手段仍相对有限［3］。传统的病原体检测技术存在一定的局限性，加之重症病人往往合并多重感染以及临床抗菌药物的滥用，在一定程度上增加了病原体鉴定难度［4］。临床微生物培养以及核酸扩增技术是目前临床上用以诊断呼吸道感染性疾病病人病原微生物的重要手段，但上述两种方式均存在一定的局限性。故此，寻求一种更为高效、准确的诊断方式显得尤为重要，亦是目前临床研究的热点。基于宏基因组测序的检测技术是近年来发展起来的一种快速、准确获取核酸序列信息的技术，且具有灵敏度高、检测周期快以及不受人类基因组DNA影响等优势，已成为重要的病原学诊断技术之一，有成为快速、普适的感染性疾病病原体鉴别手段的潜在价值［5-6］。鉴于此，本研究通过研究基于宏基因组测序的检测技术对呼吸道感染性疾病的诊断作用，旨在为临床检测提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年6月至2021年7月深圳市龙岗区第二人民医院收治的呼吸道感染性疾病病人92例。其中男性57例，女性35例；年龄（41.29±6.63）岁。入组标准［7］：（1）所有受试者年龄范围为6～77岁，男女不限；（2）均为临床可疑呼吸道感染，且经医生判断需行支气管肺泡灌洗（BALF）病原学诊断；（3）所有受试者均可耐受支气管镜检查；（4）入组前并未接受任何抗感染治疗。剔除标准：（1）病原学诊断明确或通过经验性治疗获益者；（2）临床高度怀疑RNA病毒所致感染；（3）意识障碍或合并精神疾病者；（4）正参与其他研究者。

本研究获深圳市龙岗区第二人民医院伦理委员会批准（批号19261），病人或其近亲属对研究方案签署知情同意书。

1.2 研究方法 （1）传统病原学检查：即由临床医生综合评估病人具体情况，选用目前已有的诊断方式。如针对细菌、真菌采用培养、涂片镜检法以及抗原检测试验；针对结核或肺结核分枝杆菌采用抗酸染色、培养及结核的基因检测；针对病毒和非典型病原体实施核酸检测。（2）基于宏基因组测序的检测：采用高通量测序技术（美国iIIumina公司），由医院同一名经验丰富的医师对样本中的微生物DNA序列开展宏基因组分析，并将其和数据库中的微生物核酸序列实施比对，综合受试者临床表现和实际情况，完成病原微生物的鉴定。该检测技术最低检测限为5～50 copies/mL，检测范围涵盖当前已知的病原体包括细菌6 047种，病毒7 098种，真菌812种，寄生虫138种，支原体96种，衣原体85种，立克次氏体90种，分枝杆菌94种。

1.3 评价指标 最终诊断的判定：以所有受试者出院时诊断结果作为“金标准”，最终诊断在所有受试者出院时由所在科室充分讨论后明确，并参考临床表现特点、传统微生物检测结果、基于宏基因组测序的检测结果、组织病理学结果以及治疗效果等确定。

1.4 统计学方法 数据处理选择SPSS 22.0软件。计量资料以表示，采用正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布，行t检验。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同检测方式检出病原体情况对比 宏基因组测序检测共检出45例病原体阳性，传统检测方式共检出40例病原体阳性，两种检测方式对细菌、真菌、巨细胞病毒、结核分枝杆菌以及非结核分枝杆菌的检出率对比均差异无统计学意义（P＞0.05）；宏基因组测序检测的复数病原检出率为19.57%（18/92），高于传统检测方式的8.70%（8/92），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同检测方式检出病原体情况对比/例（%）

2.2 不同检测方式诊断呼吸道感染性疾病的结果分析 宏基因组测序检测技术共检出呼吸道感染性疾病47例，其中2例误诊，1例漏诊，传统检测方式共检出呼吸道感染性疾病48例，其中8例误诊，6例漏诊。见表2。

表2 不同检测方式诊断呼吸道感染性疾病结果分析/例（%）

2.3 不同检测方式诊断呼吸道感染性疾病灵敏度、特异度及准确度对比 宏基因组测序检测诊断呼吸道感染性疾病灵敏度、特异度及准确度分别为97.83%（45/46）、95.65%（44/46）、96.74%（89/92），均高于传统检测方式的86.96%（40/46）、82.61%（38/46）、84.78%（78/92），均差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

表3 不同检测方式诊断呼吸道感染性疾病灵敏度、特异度及准确度对比/%

3 讨论

呼吸道感染性疾病一直以来均是全球范围内重要致死性疾病之一，世界卫生组织（WHO）相关统计数据表明，2016年全世界死于感染性疾病的病人突破5 600万，其中呼吸道感染性疾病死亡人数占据一定比例［8-10］。呼吸道感染性疾病的病原体相对复杂，涵盖细菌、病毒、真菌以及寄生虫等，而当前的临床微生物检测手段仍以培养、染色镜检等传统方式为主，尽管近年来核酸扩增检测以及分子免疫学检查等检测手段应运而生，但存在样本处理过程较为复杂、检查费用较为昂贵以及可检测病原体种类不多等不足之处，从而可能增加了感染性疾病的病原学诊断、病情判断以及治疗方案制定等的难度［11-13］。相关研究报道显示，临床上仍有部分感染性疾病病人病原体较难明确［13］。宏基因组测序技术主要是指将高通量测序技术应用于临床微生物检测中，其可通过直接从检测样本中提取所有微生物核酸，从而实施无差别、无选择性的大规模测序，并将测序信息和已知微生物数据库进行比对，继而为临床病原体的鉴别诊断提供可靠依据［14-16］。

本研究结果发现，宏基因组测序检测诊断呼吸道感染性疾病灵敏度、特异度及准确度均高于传统检测方式，差异有统计学意义。这在既往相关研究报道中得以佐证［17-18］，相较于传统检测方法而言，宏基因组测序检测技术诊断呼吸道感染性疾病的效能较佳。考虑原因，宏基因组测序检测技术不依赖病原体培养结果，同时无须对可疑病原体标志核酸序列实施靶向扩增，从而可在最大限度上保证检测结果的客观性以及全面性，是对传统实验室检测手段的有效补充。另有研究报道指出［19-21］，宏基因组测序相较于传统检测方式的优势之一是检测时间较短，目前宏基因组测序获取病原体遗传信息的时间往往在48 h内，平均时间在24 h左右，明确病原体最短时间仅需9 h，而传统病原体检测方式的时间普遍需要3～5 d。较短的检查时间提示了临床医生可更快地评估病原体，继而为临床治疗方案的制定提供参考依据，这对减少广谱抗菌药物的应用以及改善病人预后均有极大益处。另外，宏基因组测序检测共检出45例病原体阳性，传统检测方式共检出40例病原体阳性，两种检测方式对细菌、真菌、巨细胞病毒、结核分枝杆菌以及非结核分枝杆菌的检出率对比均不明显；宏基因组测序检测的复数病原检出率高于传统检测方式。这提示了宏基因组测序检测呼吸道感染性疾病病原体的价值较高，尤其是在检测复数病原中的效果更佳。究其原因，可能和该检测方式诊断病原体的非培养依赖性以及无偏移性密切相关。然而，将宏基因组测序技术推广普及至常规实验室检测工作中，尚且存在几点亟待解决的问题：（1）检测流程标准化，包括标本采集和保存、核酸序列提取和污染物处理、高效且准确的生物信息学分析；（2）如何降低硬件设施配置要求，缩短周转时间，提高检测灵敏度；（3）减少检测费用，加强人工操作的针对性培训；（4）结果判定指导等；（5）宏基因组测序结果无法直接实现感染病原体的确诊，仍需临床医师结合病人实际情况进行最终诊断，从而可能存在误诊的风险。

综上所述，基于宏基因组测序的检测技术应用于呼吸道感染性疾病的诊断中可获得较为理想的效果，明显优于传统检测方式，具有较高的临床推广应用价值。