重症急性胰腺炎病人外周血微RNA-143-3p、环氧合酶-2表达水平与辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的关系

邓雍，马涛，张宁

作者单位：1榆林市第一医院重症医学科，陕西 榆林719000；2榆林市第二医院消化内科，陕西 榆林719000

急性胰腺炎（acute pancreatitis， AP）是一种急腹症，其有轻症AP（mild acute pancreatitis， MAP）与重症AP（severe acute pancreatitis，SAP）两种类型，其中SAP病情进展迅速、病死率高［1-2］。因此，寻找与SAP病理发展的相关因素，对及时制定干预措施，改善SAP病人生存状况有积极意义。研究认为，SAP与微RNA（microRNA，miRNA）表达失调、胆道感染、免疫紊乱、饮酒过量、炎症反应等有关［3-4］。研究发现，微RNA-143-3p（microRNA-143-3p，miR-143-3p）在支原体肺炎中呈低表达，其可能通过调节肺部炎症反应进而影响肺炎病理进展［5］；环氧合酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）在AP中表达水平升高，COX-2抑制剂可通过降低炎症反应进而抑制SAP发展［6］；且Li等［7］研究发现，miR-143-3p可靶向调节COX-2表达水平；此外，辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）/调节性T细胞（regulatory T cells， Treg）在SAP中水平较高，Th17/Treg可能参与SAP病变过程［8］。基于上述研究，本研究通过测定SAP病人外周血中miR-143-3p、COX-2 mRNA表达水平，旨在分析其与Th17/Treg平衡的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年12月至2020年9月榆林市第一医院收治的AP病人103例为研究对象，男68例，女35例，年龄范围为24～68岁，年龄（48.52±15.17）岁。纳入标准：（1）病人符合《中国急性胰腺炎诊治指南（2013年，上海）》［9］中AP诊断标准；（2）病人发病6 h内入院；（3）病人首次发生AP。排除标准：（1）合并HIV感染、恶性肿瘤者；（2）合并妊娠、乙肝、糖尿病者；（3）有慢性胰腺炎病史者；（4）合并自身免疫性疾病者。对所有AP病人进行急性生理与慢性健康评分Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ， APACHE Ⅱ）评估，按APACHEⅡ评分将其分为SAP组（APACHEⅡ评分≥8分，45例）和MAP组（APACHEⅡ评分＜8分，58例）。SAP组：男29例，女16例，年龄范围为24～68岁，年龄（48.94±15.53）岁。MAP组：男39例，女19例，年龄范围为24～68岁，年龄（48.19±15.10）岁。并纳入同期体检健康者55例为健康组，男36例，女19例，年龄范围为24～68岁，年龄（48.13±15.05）岁。三组性别比例、年龄比较，差异无统计学意义（χ2=0.09，P=0.930；F=0.04；P=0.958）。受试者对本研究知情同意。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 研究方法 收集AP病人入院时和体检健康者体检当日5～6 mL空腹外周血，分成两份，1份静置30 min后以4 200 r/min离心7 min，留取上清液（血清），置于-70 ℃环境中保存；另1份置于含肝素的抗凝管中，待检。

利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法检测血清miR-143-3p、维甲酸相关孤核受体（retinoic acid-related orphan receptorγt，RORγt） mRNA、COX-2 mRNA、叉头/翼状螺旋转录因子3（forkhead or winged helix transcription，Foxp3） mRNA表达水平，具体操作如下：解冻血清，以TRIzol LS Reagent（上海信裕生物科技有限公司，XY1901B）提取总RNA；采用HiScript 1st Strand cD-NA Synthesis Ki（t南京诺唯赞生物科技股份有限公司，R111-01/02）制备cDNA；最后，以SYBR Green Realtime PCR Master Mix（美国ToYoBo公司，QPK-212）、qRT-PCR仪（美国Bio-Rad公司，CFX96）获取各指标循环阈值（CT值）。qRT-PCR仪参数：96.4 ℃5 min；94.5 ℃ 15 s，59.5 ℃ 40 s，62.5 ℃ 20 s，40个循环。RORγt、COX-2、Foxp3以GAPDH为内参，miR-142-5p以U6为内参，引物序列见表1。

表1 miR-143-3p、U6、RORγt、COX-2、Foxp3、GAPDH的引物序列

miR-143-3p、RORγt、COX-2、Foxp3 mRNA相对表达量以2-ΔΔCt法计算。

Th17、Treg细胞水平检测：取抗凝管内的外周血，利用人Ficoll淋巴细胞分离液（上海瓦兰生物科技有限公司，wlb1083）按密度梯度离心法获得外周血单个核细胞（PBMCs），以RPMI 1640培养液（厦门慧嘉生物科技有限公司，GMS12052.4.1）稀释PBMCs，其密度为1.5×109个/升，使用流式细胞仪（美国BD公司，FACSCanto Ⅱ）测定Th17、Treg细胞百分比，计算Th17/Treg。

1.3 统计学方法 SPSS 22.0软件处理数据。计量资料均符合正态分布，以表示，行单因素方差分析。采用SNK-q检验；Pearson相关法分析SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表达水平与外周血Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相关性； SAP发生的影响因素采用logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平比较 与健康组相比，MAP组、SAP组病人血清miR-143-3p表达水平及Treg细胞百分比降低（P＜0.05），COX-2 mRNA表达水平及Th17细胞百分比、Th17/Treg升高（P＜0.05）；与MAP组相比，SAP组病人血清miR-143-3p表达水平及Treg细胞百分比降低（P＜0.05），COX-2 mRNA表达水平及Th17细胞百分比、Th17/Treg升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组血清miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平比较/

表2 各组血清miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平比较/

注：miR-143-3p为微RNA-143-3p，COX-2为环氧合酶-2，Th17为辅助性T细胞17，Treg为调节性T细胞。SAP为重症急性胰腺炎，MAP为轻症急性胰腺炎。①与健康组相比，P＜0.05。②与MAP组相比，P＜0.05。

Th17/Treg 0.23±0.08 0.63±0.21①2.46±0.82①②325.93＜0.001组别健康组MAP组SAP组F值P值例数55 58 45 miR-143-3p 1.04±0.35 0.70±0.23①0.42±0.14①②71.25＜0.001 COX-2 mRNA 1.01±0.34 1.68±0.48①2.37±0.54①②110.46＜0.001 Th17/%1.99±0.66 3.87±1.29①6.71±2.34①②119.40＜0.001 Treg/%8.74±2.91 6.13±2.04①2.73±0.90①②94.93＜0.001

2.2 各组血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比较 与健康组、MAP组相比，SAP组病人血清RORγt mRNA表达水平升高（P＜0.05），Foxp3 mRNA表达水平降低（P＜0.05）；与健康组相比，MAP组病人血清RORγt mRNA表达水平升高（P＜0.05），Foxp3 mRNA表达水平降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比较/

表3 各组血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比较/

注：RORγt为维甲酸相关孤核受体，Foxp3为叉头/翼状螺旋转录因子3，SAP为重症急性胰腺炎，MAP为轻症急性胰腺炎。①与健康组相比，P＜0.05。②与MAP组相比，P＜0.05。

例数55 58 45 RORγt mRNA 1.05±0.35 1.72±0.57①2.44±0.81①②68.73＜0.001组别健康组MAP组SAP组F值P值Foxp3 mRNA 1.03±0.34 0.56±0.19①0.31±0.11①②119.44＜0.001

2.3 SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表达水平与外周血Th17、Treg、Th17/Treg相关性Pearson相关法分析显示，SAP病人血清miR-143-3p表达水平与Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg及血清COX-2 mRNA表达水平与Treg、Foxp3 mRNA呈负相关（P＜0.05）；血清miR-143-3p表达水平与Treg、Foxp3 mRNA及血清COX-2 mRNA表达水平与Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg呈正相关（P＜0.05）。SAP病人血清miR-143-3p表达水平与COX-2 mRNA呈负相关（r=-0.40，P=0.070）。见表4。

表4 SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表达水平与外周血Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相关性

2.4 影响SAP发生的logistic回归分析 以SAP是否发生为因变量（未发生=0，发生=1），以Th17、RORγt mRNA、Treg、Foxp3 mRNA、Th17/Treg、miR-143-3p、COX-2 mRNA为自变量，纳入logistic回归分析，结果显示，miR-143-3p是影响SAP发生的保护因素（P＜0.05），COX-2 mRNA、Th17/Treg是影响SAP发生的危险因素（P＜0.05）。见表5。

表5 logistic回归分析SAP发生的影响因素

3 讨论

SAP是一种全身炎症反应综合征，其可引发胰腺组织出血、水肿、坏死，引起多器官功能障碍，甚至导致死亡［10-11］。因此，寻找与SAP病理变化有关的标志物，对诊治SAP、改善SAP病人生存质量甚是重要。

miRNA是一类非编码RNA，其可调节炎症反应，参与免疫调节，影响信号转导，与胰腺癌、胆囊炎、AP等密切相关［12-14］。研究［15］发现，miR-143-3p在支气管哮喘中表达水平降低，其可能通过影响炎症反应及支气管细胞凋亡，从而在支气管哮喘中发挥作用；另外，miR-143-3p在胰腺导管腺癌中表达下调，其可能靶向结合有关基因进而抑制胰腺导管腺癌病理发展，miR-143-3p可能是治疗胰腺导管腺癌的潜在靶标［16］。本研究中SAP组病人血清miR-143-3p表达水平低于MAP组、健康组，提示miR-143-3p表达失调可能与SAP病理过程相关，且测定血清miR-143-3p水平，有助于临床评估AP病人病情，推测miR-143-3p作为miRNA的一员，其可能通过影响炎症反应，进而影响SAP发病过程。COX-2是一种诱导酶，定位于内质网、核膜，其可被炎性介质等多种因子诱导，促进炎症反应，加剧组织损伤，与胰腺癌、胰腺炎等关系密切［17-18］。研究［19］发现，COX-2在黏液性胰腺囊肿中过表达，其可能促进黏液性胰腺囊肿病理发展；另外，COX-2在SAP中呈高表达，COX-2可能参与SAP发生发展［20］。本文中SAP组病人血清COX-2 mRNA表达水平高于MAP组、健康组，与文玲等［20］研究趋势相符，提示COX-2 mRNA可能与SAP发展进程有关，其具有评估AP疾病严重程度的价值，推测COX-2可能促进炎症反应进而加速SAP发生发展。

Th17/Treg平衡是维持机体免疫平衡的重要环节，其在SAP中水平较高，Th17/Treg可能影响SAP发病进程［21］。本文中SAP、MAP组病人Th17细胞百分比、Th17/Treg高于健康组，Treg细胞百分比低于健康组，且AP病人病情越严重，Th17细胞百分比、Th17/Treg越高，Treg细胞百分比越低，与赵瑞臣等［8］研究结果相符，提示Th17/Treg失衡可能影响SAP病理进展。且RORγt是Th17细胞的关键转录因子，其可调节IL-17分泌，参与Th17细胞分化，调节炎症反应；另外，Foxp3作为Treg的重要转录因子，可与染色体结合，影响Treg细胞发育，调节有关基因表达［22-23］。近期研究发现，SAP病人RORγt mRNA表达水平较高，Foxp3 mRNA表达水平较低，40例SAP病人入院后给予清胰利胆颗粒与床旁CRRT疗法联合治疗后，RORγt mRNA表达水平降低（t=24.59，P＜0.001），Foxp3 mRNA表达水平水平升高（t=44.17，P＜0.001），RORγt mRNA、Foxp3 mRNA可能参与SAP疾病进展［24］。本研究显示，SAP、MAP病人血清RORγt mRNA表达水平高于健康者，血清Foxp3 mRNA表达水平低于健康者，且SAP病人血清RORγt mRNA表达水平高于MAP病人，血清Foxp3 mRNA表达水平低于MAP病人，与李芳等［24］研究相似，提示RORγt mRNA、Foxp3 mRNA 可能与SAP病理发展有关，推测RORγt mRNA、Foxp3 mRNA可能通过影响机体免疫功能，进而影响SAP病理过程。

本研究分析了SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表达水平与Th17/Treg平衡的关系，结果显示，血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表达水平与Th17、Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA、Th17/Treg均显著相关，提示miR-143-3p、COX-2 mRNA可能与Th17、Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA、Th17/Treg共同影响SAP病理变化。此外，SAP病人血清miR-143-3p表达水平与COX-2 mRNA呈负相关，提示miR-143-3p可能与COX-2 mRNA协同影响SAP发生发展，但其具体机制有待深入研究。进一步研究发现，血清miR-143-3p水平降低，COX-2 mRNA水平、Th17/Treg升高均可能会升高SAP发生风险，及时确定miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17/Treg水平有助于临床诊治SAP。

综上，SAP病人血清miR-143-3p表达水平较低，COX-2 mRNA表达水平较高，miR-143-3p、COX-2 mRNA均与Th17/Treg平衡有关，miR-143-3p可能是治疗SAP的潜在靶标。但本研究对miR-143-3p在SAP中的作用机制研究仍不够深入，后续将扩大样本从多角度进行研究。