血清长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因1、微RNA-329-3p表达水平与急性脑梗死发生风险的关系

滕玉环，徐晨辉，陈季南，李军荣

作者单位：南京市江宁医院神经内科，江苏 南京211100

急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）是由于各种原因导致大脑动脉狭窄或堵塞引起大脑供血不足的脑血管疾病，是临床较为常见的神经系统疾病之一，临床症状主要表现为头晕、语言及肢体功能障碍等，严重者可有意识障碍，常突然发病，病情可迅速进展，严重威胁病人生命健康。研究表明，ACI的发病机制极为复杂，高龄、动脉硬化、血液高黏滞性等与ACI的发病有着密切的关系［1-3］。因此，研究与ACI有关的标志物及其与疾病发生风险的关系，对ACI的早期防治具有重要意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的内源性非编码RNA，可通过调控其他基因的转录、翻译过程在细胞分化、凋亡等多种生理病理过程中发挥重要作用，近年来有研究表明，lncRNA异常表达与脑血管疾病的发生关系密切［4］。长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）作为一种lncRNA，其表达参与调节血管内皮细胞增殖和血管生成［5］。据报道，lncRNA SNHG1可通过抑制神经炎细胞凋亡延缓ACI进展，在ACI的发生发展过程中发挥重要作用［6］。微RNA（microRNAs，miRNAs）是一类非编码小分子RNA，研究表明，其在脑血管疾病的发生发展过程中具有重要作用［7］，通过在生物信息学StarBase网站（http：//starbase.sysu.edu.cn/）发现lncRNA SNHG1、miR-329-3p存在结合位点，因此本研究探讨了lncRNA SNHG1、miR-329-3p二者与ACI的关系，miR-329-3p作为一种miRNAs，是14q32 miRNA基因簇的成员，研究表明，多种14q32 miRNA分子在血管重塑中发挥重要作用，可延缓心血管疾病的发生发展［8］。目前关于lncRNA SNHG1、miR-329-3p在脑血管疾病中的临床相关研究甚少，因此本研究通过检测ACI病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p表达水平变化，探讨其与疾病发生风险的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年9月至2021年9月在南京市江宁医院收治的162例ACI病人作为观察组，其中男90例，女72例，年龄范围为49～85岁，年龄（66.96±13.98）岁，卒中病因学分型：大动脉粥样硬化61例、小血管闭塞47例、心源性栓塞35例、其他19例。纳入标准：①符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》［9］中关于ACI的诊断标准；②经头颅MRI检查确诊证实；③住院时间＞7 d；④临床资料完整；⑤病人或其近亲属知情同意并签署知情同意书。排除标准：①合并肝硬化、脂肪肝等肝胆系统疾病；②近半年内有创伤史和外科手术史；③患有自身免疫性疾病、肿瘤、精神疾病；④合并冠心病等心血管疾病；⑤近期服用抑制炎症类药物、免疫抑制剂等。另选取同时期在本院体检的165例健康志愿者作为对照组，其中男88例，女77例，年龄范围为48～86岁，年龄（66.52±14.04）岁。ACI病人严重程度根据美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）［10］分为轻度ACI组60例（NIHSS≤7分）、中度ACI组56例（8分≤NIHSS≤13分）和重度ACI组46例（NIHSS≥14分）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集 收集所有受试者以下临床资料：性别、年龄、吸烟史、饮酒史、高血压和糖尿病病史、身体质量指数（body mass index，BMI）、NIHSS评分、收缩压（systolic pressure，SBP）、舒张压（diastolic pressure，DBP）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDLC）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）等。

1.2.2 样品采集 所有ACI病人入院次日清晨及体检者体检当时采集空腹静脉血5 mL，将收集的血液标本以3 000 r/min的转速离心10 min后取上层血清，置于-80 ℃冰箱中待测。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p的相对表达量 取所有血清样本，加入1 mL Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取总RNA，测定RNA纯度和浓度，将其反转录为cDNA，采用qRT-PCR对lncRNA SNHG1、miR-329-3p进行扩增，引物序列见表1。lncRNA SNHG1反应条件为：95 ℃，5 min；96 ℃，10 s；60 ℃，35 s；以GAPDH作为内参。miR-329-3p反应条件为：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；75 ℃，50 s；以U6作为内参，采用2-ΔΔCt法分析lncRNA SNHG1、miR-329-3p的表达水平。lncRNA SNHG1、GAPDH、miR-329-3p、U6引物序列由上海基因化学有限公司构建；qRT-PCR仪（型号Applied Biosystems 9700）购自美国Life Technologies公司。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.3 统计学方法 用SPSS 25.0软件进行数据统计学分析，计量资料（呈正态分布，且方差齐）以表示，两组间比较采用独立样本t检验，三组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间的比较采用SNK-q检验；等级资料（NIHSS评分）比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料采用例（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman法分析lncRNA SNHG1、miR-329-3p与NIHSS评分的关系；采用Pearson法分析lncRNA SNHG1与miR-329-3p水平的关系；使用ROC曲线分析lncRNA SNHG1、miR-329-3p对ACI的诊断价值；多因素logistic回归分析ACI发生的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般临床资料比较 两组病人性别、年龄、吸烟史、饮酒史、BMI、SBP、DBP、HDL-C、LDL-C等比较均差异无统计学意义（P＞0.05），观察组高血压史比例、糖尿病病史比例、NIHSS评分、TC、TG显著高于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 急性脑梗死及健康志愿者一般临床资料比较

2.2 两组血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比较 与对照组比较，观察组病人lncRNA SNHG1水平明显降低，miR-329-3p水平明显升高（P＜0.05），见表3。

表3 两组血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比较/

表3 两组血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比较/

注：lncRNA SNHG1为长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因1，miR-329-3p为微RNA-329-3p。

miR-329-3p/U6 1.01±0.03 2.15±0.70 20.90＜0.001组别对照组观察组t值P值例数165 162 lncRNA SNHG1/GAPDH 1.03±0.04 0.34±0.08 98.91＜0.001

2.3 不同严重程度病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比较 与轻度ACI组比较，中度ACI组病人lncRNA SNHG1水平明显降低，miR-329-3p水平明显升高（P＜0.05），与中度ACI组比较，重度ACI组病人lncRNA SNHG1水平明显降低，miR-329-3p水平明显升高（P＜0.05），见表4。

表4 不同严重程度急性脑梗死病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比较/

表4 不同严重程度急性脑梗死病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比较/

注：lncRNA SNHG1为长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因1，miR-329-3p为微RNA-329-3p。①与轻度ACI组比较，P＜0.05。②与中度ACI组比较，P＜0.05。

miR-329-3p/U6 1.51±0.50 2.20±0.69①2.92±0.97①②49.63＜0.001组别轻度ACI组中度ACI组重度ACI组F值P值例数60 56 46 lncRNA SNHG1/GAPDH 0.43±0.09 0.35±0.08①0.21±0.07①②96.04＜0.001

2.4 ACI病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p与NIHSS评分的相关性以及lncRNA SNHG1、miR-329-3p之间的相关性分析 相关性分析结果显示，血清lncRNA SNHG1与NIHSS评分呈负相关（r=-0.30，P＜0.001），miR-329-3p与NIHSS评分呈正相关（r=0.63，P＜0.001）；通过生物信息学StarBase网站（http：//starbase.sysu.edu.cn/）发现lncRNA SNHG1、miR-329-3p存在结合位点，ACI病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p表达呈负相关（r=-0.61，P＜0.001）。

2.5 lncRNA SNHG1、miR-329-3p对ACI的诊断价值 ROC曲线结果显示，血清lncRNA SNHG1诊断ACI发生的ROC曲线下面积（AUC）为0.78（0.73，0.83），灵敏度为78.2%，特异度为82.7%，截断值为0.74，血清miR-329-3p诊断ACI发生的AUC为0.72（0.66，0.76），灵敏度为73.3%，特异度为67.9%，截断值为1.34，二者联合诊断ACI发生的AUC为0.83（0.78，0.87），灵敏度为73.3%，特异度为86.4%，与lncRNA SNHG1单独诊断相比，二者联合诊断ACI发生的AUC差异无统计学意义（Z=1.33，P=0.920），与miR-329-3p单独诊断相比，二者联合诊断ACI发生的AUC更高（Z=2.93，P=0.003）。

2.6 多因素logistic回归分析ACI发生的影响因素 将ACI是否发生作为因变量，以高血压史、糖尿病病史、TC、TG、lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平作为自变量进行多因素logistic回归分析，其中TC、TG、lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平均以ACI病人的平均值为界转换为二分类变量，具体赋值见表5。结果显示，高血压史、糖尿病病史、TC高水平、TG高水平、lncRNA SNHG1低水平、miR-329-3p高水平是影响ACI发生的危险因素（P＜0.05），见表6。

表5 变量赋值说明

3 讨论

ACI是临床常见的脑血管疾病，在我国约占急性脑血管病的70%～80%，ACI具有高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率特征，并且发病率和复发率呈逐年上升趋势，严重影响病人的生活质量和生命健康。血清学检测是一种非侵入性、便捷的早期筛查方法，因此，寻找与ACI有关的血清标志物以及探讨其与疾病发生风险的关系，对ACI的早期防治具有重要意义［11-13］。

据报道，SNHG1是一个与癌症有关的lncRNA，已有大量研究结果表明，lncRNA SNHG1参与心肌细胞肥大［14］、心肌缺血/再灌注损伤［15］等多种心血管疾病的发生发展过程，此外，最近的研究表明，lncRNA SNHG1异常表达还与脑血管疾病的发生有关，例如Zhang等［16］研究结果表明，lncRNA SNHG1可减小大脑中动脉闭塞小鼠模型的脑梗死面积，而抑制lncRNA SNHG1表达则会增大脑梗死面积，且lncRNA SNHG1可作为miR-18a的竞争性内源性RNA发挥作用，从而调节其内源性靶标缺氧诱导因子-1α的去抑制，并通过缺氧诱导因子-1α/血管内皮细胞生长因子信号传导促进脑微血管内皮细胞（BMEC）存活。Wang等［17］研究结果表明，lncRNA SNHG1的异常表达与缺血性中风后的血管生成有关，lncRNA SNHG1对BMEC存活和血管生成中形态、功能的影响依赖于miR-199a，miR-199a参与调节缺氧诱导因子和血管内皮细胞生长因子的表达。本研究结果表明，与对照组相比，观察组病人血清lncRNA SNHG1表达水平显著降低，提示lncRNA SNHG1异常低表达可能与ACI的发生有关。进一步研究表明，血清lncRNA SNHG1水平随病情严重程度增加而降低，且ACI病人血清lncRNA SNHG1水平与NIHSS评分呈负相关，表明lncRNA SNHG1表达水平变化与病人病情严重程度有关，检测其表达可能对评估病人病情严重程度有帮助。ROC曲线分析表明，lncRNA SNHG1诊断ACI发生的AUC为0.78，灵敏度为78.2%，特异度为82.7%，提示lncRNA SNHG1对ACI具有良好的诊断价值。此外，多因素logistic回归分析显示，lncRNA SNHG1低水平是影响ACI发生的危险因素，提示lncRNA SNHG1可作为ACI风险预测的标志物。

miRNAs是一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA，具有调控多种动植物基因转录翻译的生物学功能，人们发现miRNAs异常表达与心脑血管疾病的发生关系密切［18］，miR-329-3p作为一种miRNAs，miR-329-3p异常表达不仅与多种癌症的发生密切相关，且在心脑血管疾病的发生中发挥重要作用，Goossens等［19］研究结果表明，抑制miR-329-3p表达，可增加缺血后血管生成，从而减轻血管疾病的发生。Rafiei等［20］研究结果表明，冠心病病人外周血单核细胞miR-329呈高表达，miR-329异常高表达与动脉粥样硬化斑块的发生有关。Lin等［21］研究结果表明，在神经元分化过程中，miR-329-3p的表达上调，而转录因子E2F1的表达下调，miR-329-3p可通过抑制E2F1在调节神经干细胞增殖中发挥关键作用。以上结果表明miR-329表达与血管疾病有关。本研究结果表明，与对照组相比，观察组病人血清miR-329-3p水平明显升高，且其水平随病人病情的加重而升高，与Rafiei等［20］研究类似，提示miR-329-3p异常高表达可能参与ACI的发生，且可作为评估病人病情严重程度的指标之一。经Spearman法分析发现，ACI病人血清miR-329-3p水平与NIHSS评分呈正相关，进一步表明miR-329-3p表达水平与病人病情严重程度有关。此外，本研究还发现，血清miR-329-3p水平可作为诊断ACI的有效指标，且高血压史、糖尿病病史、TC高水平、TG高水平、miR-329-3p高水平是影响ACI发生的危险因素，提示miR-329-3p对评估ACI的发生风险有积极作用。临床上不仅要关注影响ACI发生的常见因素（高血压、糖尿病及血脂指标），还需密切注意lncRNA SNHG1、miR-329-3p在ACI发病中的作用。

NIHSS评分是评估ACI病人神经功能缺损程度的指标，但NIHSS评分主观性强，在部分昏迷及反应迟钝的老年人中应用不理想［22］。因此，本研究拟选用稳定的血清指标（lncRNA SNHG1、miR-329-3p）辅助诊断ACI，结果表明，lncRNA SNHG1、miR-329-3p对诊断ACI均有帮助，二者联合诊断ACI发生的AUC更高，且可提高对ACI诊断的特异度。He等［23］研究报道，lncRNA SNHG1可能通过调节miR-329-3p的表达在小胶质细胞活化中发挥重要作用。本研究发现，ACI病人血清中lncRNA SNHG1与miR-329-3p的表达水平呈负相关，提示lncRNA SNHG1、miR-329-3p可能共同参与ACI的发生，推测lncRNA SNHG1可能通过靶向调控miR-329-3p的表达参与ACI的发生，但具体调控机制还需后续研究。