金莲花口服液高效液相色谱指纹图谱建立及指标成分含量测定

2023-10-17潘燕

中国药业 2023年19期

潘燕

（浙江康恩贝制药股份有限公司·浙江省中药制药技术重点实验室，浙江金华 321109）

金莲花口服液是由毛茛科植物金莲花Trollius chinensisBge. 的干燥花制成的单方制剂［1］，含有黄酮类和生物碱类成分，具有良好的清热、解毒、消肿、抗菌、抗病毒作用，可用于上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎、口疮、急性鼓膜炎、急性淋巴管炎等疾病的治疗［2］。目前，除口服剂型外，片剂、胶囊剂、颗粒剂等其他剂型均收载于《中国药典（一部）》，并以荭草苷（C21H20O11）为指标成分控制含量［1］。指纹图谱技术可对中药制剂中的各类成分进行分析，在有效成分难以明确的情况下，能较全面地反映中药制剂中所含化学成分组成及占比，在评价质量一致性及产品稳定性方面具有明显优势［3-8］。为此，本研究中建立了金莲花口服液的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并同时测定荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素的含量，为金莲花制剂的质量控制及相关产品的研发、生产提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；XSE205DU 型电子天平（瑞士Mettler - Toledo 公司，精度为十万分之一）；Milli - Q 型超纯水仪（美国Millipore 公司）；WSZ - 100A 型回旋振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药

荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品（振强生物技术有限公司，批号为20191003，纯度为99.85%）；荭草苷对照品（批号为111777 - 202003，纯度为98.0%），牡荆苷对照品（批号为111687-201704，纯度为94.9%），槲皮素对照品（批号为100081-201610，纯度为99.1%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯，购自美国Merck 公司；磷酸（EP，西班牙Scharlau公司）；水为纯化水；金莲花口服液（浙江康恩贝制药股份有限公司，批号分别为JL2081-1，JL2081-2，JL2081-3，JL2082-1，JL2082-2，JL2082-3，JL2083-1，JL2083-2，JL2083-3，JL2181-1，JL2181-2，21JL81-3，JL2182-1，JL2182-2，JL2181-3，JL2183-1，JL2183-2，JL2183-3，编号为S1-S18，规格为每支10 mL）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kinetex - XB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.35%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～12 min 时12%A，12～25 min 时12%A →15%A，25～28 min 时15%A →19%A，28～40 min 时19%A →23%A，40～46 min 时23%A →25%A，46～55 min 时25%A，55～60 min 时25%A →33%A，60～65 min 时33%A，65～70 min时33%A →90%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：340 nm；进样量：5µL。

2.2 溶液制备

精密量取样品5 mL，置100 mL 容量瓶中，加甲醇80 mL，回旋振荡30 min，加甲醇定容，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10 mL，置25 mL 容量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品各适量，精密称定，加50%甲醇溶解，制成每1 mL 含荭草素- 2″ -O-β-L- 半乳糖苷50µg、荭草苷60µg、牡荆苷18µg、槲皮素5µg 的混合对照品溶液。

按处方比例称取蔗糖50.00 g、羟苯乙酯0.10 g、苯甲酸钠0.90 g，精密称定，置500 mL 容量瓶中，用纯化水溶解并定容，按供试品溶液制备方法制备缺金莲花的阴性对照品溶液。

2.3 HPLC 指纹图谱建立

2.3.1 方法学考察

重复性试验：取样品（编号为S5）6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，以荭草苷（4 号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD在0～0.29%之间（n=6），相对峰面积的RSD在0～2.76%之间（n=6），表明方法重复性良好。

中间精密度试验：取样品（编号为S5）6 份，依法制备供试品溶液，不同人员于不同时间利用不同仪器按2.1 项下色谱条件进样测定，以荭草苷（4 号峰）为参照峰，并与重复性试验项下供试品溶液共12 份计算各共有峰相对保留时间的RSD在0～1.10%之间（n= 12），相对峰面积的RSD在0～2.92%之间（n= 12），表明方法中间精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为S5），按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，4，8，12，24，36，48，60，72，84，96 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，以荭草苷（4 号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD在0～1.81%之间（n= 11），相对峰面积的RSD在0～2.84%之间（n= 11），表明供试品溶液在室温下放置96 h内稳定性良好。

2.3.2 对照图谱生成及共有峰标定

取样品（编号为S1-S18），按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）进行分析，以S1为参照图谱，选择中位数法，设定时间窗宽度为0.1 min，生成对照图谱，确定22个共有峰。详见图1。通过与混合对照品溶液色谱图进行对比，指认了4 种指标性成分，分别为2 号峰（荭草素- 2″ -O-β-L- 半乳糖苷）、4 号峰（荭草苷）、8 号峰（牡荆苷）、17 号峰（槲皮素）。其中，荭草苷分离度较好，保留时间适中，峰面积最大，峰形对称，故选择其为参照峰（S）。

图1 18批金莲花口服液高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC overlay fingerprints of 18 batches of Jinlianhua Oral Liquid

2.3.3 相似度评价

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）计算18批样品（编号为S1-S18）的相似度，结果相似度均不低于0.988，表明不同批次样品相似度高。详见表1。

表1 18批金莲花口服液指纹图谱相似度评价结果Tab.1 Similarity results of fingerprints of 18 batches of Jinlianhua Oral Liquid

2.4 指标性成分含量测定

2.4.1 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下供试品溶液、混合对照品溶液、阴性对照品溶液各5µL，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果各成分色谱峰与相邻色谱峰分离度均大于1.5，且阴性对照无干扰。详见图2。

图2 专属性试验高效液相色谱图2.2″-O-β-L-Galactopyanosylorientin 4.Orientin 8.Vitexin 17.QuercetinA.Negative reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms of the specificity test

线性关系考察：取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品各适量，精密称定，分别用50%甲醇溶解并逐级稀释成系列质量浓度的溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，以对照品溶液质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表2。

表2 线性关系考察及检测限、定量限确定结果Tab.2 Results of the linear relation test，LOD and LOQ

检测限和定量限确定：取线性关系考察项下溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，分别以信噪比（S/N）为3∶1和10∶1时的质量浓度作为检测限和定量限［9］。结果见表2。

重复性试验：以2.3.1项下重复性试验图谱数据计算样品含量，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素平均含量分别为2.68，2.96，0.86，0.24 mg/ mL，RSD分别为0.44%，0.28%，0.60%，1.70%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：以2.3.1项下稳定性试验图谱数据计算，荭草素- 2″ -O-β-L- 半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素峰面积的RSD分别为0.55%，0.42%，0.62%，0.41%（n=11），表明供试品溶液在室温下放置96 h内稳定性良好。

中间精密度试验：以2.3.1项下中间精密度试验图谱数据计算样品含量，并与“2.4.1 重复性试验”项下供试品溶液含量共12 份计算荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素峰面积的RSD分别为0.89%，0.98%，1.04%，2.24%（n= 12），表明中间精密度良好。

加样回收试验：取样品（编号为S5）2.50 mL，平行6 份，分别精密加入荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、槲皮素对照品各适量，依法制备供试品溶液。结果加样回收率均在85%～110%之间，表明方法准确度良好。详见表3。

表3 4个指标性成分加样回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test of four indicator components（n=6）

2.4.2 样品含量测定

取样品（编号为S1-S18），依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，并计算含量。结果显示，同一批药材得到的制剂（编号为S1-S3，编号为S4-S6，编号为S7-S9，编号为S10-S12，编号为S16-S18）各指标性成分的含量较接近，批间略有差异。详见表4。

表4 18批样品中4个指标性成分的含量测定结果（mg/mL，n=2）Tab.4 Results of the content determination of four indicator components in 18 batches of samples（mg/mL，n=2）

3 讨论

3.1 色谱柱选择

对不同色谱柱Kromasil-100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），Thermo - Hypersil - GOLD - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm），Inevtsil ODS - 3 C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm），Kinetex - XB - C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）进行考察，结果Kinetex-XBC18柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）峰形较其他色谱柱好，故最终选择此色谱柱用于分离。