天胡荽质量标准提升研究*

2023-10-17左登平李变变鹿秀叶赵向阳

中国药业 2023年19期

左登平，李变变，鹿秀叶，赵向阳

（安徽省宿州市食品药品检验检测中心，安徽宿州 234000）

天胡荽始载于《千金食治》，广泛分布于安徽、江苏、浙江、江西、福建、台湾、湖南、湖北、广东、广西等地［1-3］，具有清热利湿、解毒消肿功效，主治黄疸、痢疾、水肿、淋病、目翳、喉肿、痈肿疮毒、带状疱疹、跌打损伤等症［4-6］。天胡荽全草含有黄酮苷、酚类、氨基酸、挥发油、香豆素等化合物，目前已从天胡荽中分离出了4 种黄酮类化合物，8种齐墩果烷型三萜类化合物，1种木质素类成分和1 种甾体成分［7-10］。其中，黄酮类成分槲皮素性质稳定，是研究天胡荽含量及评价天胡荽质量的重要指标［11-15］。天胡荽质量标准收载于《安徽省中药饮片炮制规范（2019 年版）》《上海市中药材标准（1994 年版）》《贵州省中药材民族药材质量标准（2003 年版）》《湖南省中药材标准（2003 年版）》《湖北省中药材标准（2018 年版）》等，但相关标准的项目均不全面，且部分标准中的项目有待进一步完善。本研究中对10 批天胡荽药材进行性状、显微、薄层色谱鉴别，检查水分、灰分、浸出物的含量，采用高效液相色谱法测定槲皮素的含量，建立并完善天胡荽的质量标准，为该药材的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ultimate3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司），配有Chromeleon 色谱工作站；Camag TLC SCANNER3 型薄层扫描仪（瑞士Camag 公司）；DM750 型生物显微镜（德国Leica 公司），配有ToupCamE3CMOS 成像系统；FP240 型精密干燥箱（德国Binder 公司）；KSL -1200X - M 型高温箱式炉（合肥科晶材料技术有限公司）；TA-27型超声波清洗器（湖北鼎泰高科有限公司，功率为700 W，频率为40 kHz）；BSA 124S型电子天平（德国Sartorius公司，精度为0.1 mg）；AB135 - S 型分析天平（梅特勒-托利多公司，精度为0.01 mg）。

1.2 试药

槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号为10081-201610，纯度为99.1%）；天胡荽药材样品（10批，均由安徽省中药材标准起草领导小组提供），经安徽中医药大学刘金山教授鉴定为正品，样品信息见表1；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tedia 公司）；水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

表1 天胡荽药材样品信息Tab.1 Information of Hydrocotyle sibthorpoides

2 方法与结果

2.1 性状

参照《安徽省中药饮片炮制规范（2019 年版）》，并结合10 批天胡荽药材样品实际性状，本品为不规则的段，根、茎、叶混合，偶见花与果实；根呈细圆柱形，表面为淡黄色或灰黄色；茎细而弯曲，黄绿色，节处有根痕或残留细根；叶多皱缩或破碎，完整者展平后呈近圆性或肾性，叶片浅裂个数5～7 个，浅裂或裂至叶片中部，淡绿色；伞形花序小；双悬果略呈心形，两侧扁平；气香，味微苦。详见图1。

图1 天胡荽药材性状Fig.1 Morphological character of Hydrocotyle sibthorpoides

2.2 鉴别

显微鉴别：本品的茎横切面，表皮细胞1列，外被角质层，表皮下为1 列较整齐的厚壁组织，皮层薄壁细胞5～9 列；皮层可见分泌道；外韧型维管束5～6 个，排列成环，形成层不明显；中央髓部为薄壁组织，常见分泌道。详见图2。

图2 天胡荽药材茎横切面显微特征Fig.2 Microscopic characters of stem transection of Hydrocotyle sibthorpoides

薄层色谱鉴别：取样品粉末2 g，加70%乙醇20 mL和浓盐酸2 mL，加热回流2 h，滤过，取滤液，作为供试品溶液。取槲皮素对照品，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 薄层色谱法试验，吸取10 批供试品溶液各5µL、对照品溶液2µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1，V/V/V）为展开剂，于相对湿度低于70%环境下展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的荧光斑点。详见图3。

图3 天胡荽药材薄层色谱图（365 nm）S.Reference solution 1-10.Test solutionFig.3 TLC chromatogram of Hydrocotyle sibthorpoides（365 nm）

2.3 水分、灰分及酸不溶性灰分检查

分别按2020年版《中国药典（四部）》通则0832 水分测定法第二法（烘干法）、通则2302 总灰分测定法测定水分、总灰分和酸不溶性灰分的含量，结果10批天胡荽药材中水分、总灰分、酸不溶性灰分的平均含量分别为9.0%，13.8%，4.2%，暂定天胡荽药材中水分、总灰分、酸不溶性灰分分别不得过11.0%，15.0%，4.0%。详见表2。

表2 天胡荽药材中水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物测定结果（%）Tab.2 Results of content determination of water，total ash，acidinsoluble ash and extract in Hydrocotyle sibthorpoides（%）

2.4 浸出物

按2020年版《中国药典（四部）》通则2201 浸出物测定法测定浸出物的含量，结果天胡荽药材中浸出物的平均含量为20.0%，暂定限度为不得少于16.0%。详见表2。

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C18柱（250 mm ×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：360 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 µL。此色谱条件下，供试品溶液色谱图中杂质峰对主峰无干扰，槲皮素分离度大于1.5，峰对称因子介于0.90～1.20，理论板数大于5 000，对照品溶液重复进样5次的RSD不超过1.5%。详见图4。

图4 高效液相色谱图1.QuercetinA.Reference solution B.Test solutionFig.4 HPLC chromatograms

2.5.2 溶液制备

取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5µg 的对照品溶液。取样品粉末（过3 号筛）1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min，冷却至室温，用80%甲醇补足减失的质量，滤过，精密量取续滤液25 mL，加盐酸3 mL，加热回流30 min，迅速冷却，转移至50 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.5.3 方法学考察

线性关系考察：取槲皮素对照品0.010 16 g，置100 mL容量瓶中，用80%甲醇定容，制成质量浓度为101.6µg/mL的对照品溶液，分别取0.1，0.2，0.5，0.8，1.0 mL，置10 mL 容量瓶中，用甲醇制成质量浓度分别为1.016，2.032，5.080，8.128，10.160µg/mL的系列对照品溶液。以峰面积（Y）为纵坐标、槲皮素质量浓度（X，µg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y= 0.665 4X+0.054（R2=0.999 9，n=5）。结果表明，槲皮素的质量浓度在1.016～10.160µg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取线性关系考察项下对照品溶液，按2.5.1项下色谱条件重复进样测定5次，记录峰面积。结果的RSD为0.20%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为THS - 07）适量，按2.5.2项下方法制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，16，20，24 h 时按2.5.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为3.92%（n= 7），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取稳定性试验项下供试品溶液6 份，按2.5.1 项下色谱条件进样测定，用回归方程计算含量。结果平均含量为0.072 7%，RSD为1.75%（n= 6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的天胡荽样品（编号为THS-07）粗粉0.500 g，精密称定，平行6 份，置100 mL具塞锥形瓶中，分别加入质量浓度为3.612 mg/mL 的槲皮素对照品溶液100µL，按2.5.2项下方法制备供试品溶液，按2.5.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.5.4 样品含量测定

取槲皮素对照品溶液及10批天胡荽药材样品的供试品溶液各适量，按2.5.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，分别按外标法计算样品中槲皮素的含量。结果10 批天胡荽药材中槲皮素含量分别为0.072%，0.073%，0.076%，0.073%，0.097%，0.014%，0.053%，0.038%，0.089%，0.100%，平均为0.068%。以统计学方法分析含量数据，暂定限度为按干燥品计算，含槲皮素（C15H10O7）不得少于0.050%。

3 讨论

3.1 浸出物检查考察

按2020 年版《中国药典（四部）》通则2201 浸出物测定法，考察了不同浸出方法（冷浸法、热浸法）和不同溶剂（水、稀乙醇、70%乙醇、乙醇）对浸出物含量的影响，结果热浸法的浸出物含量高于冷浸法，故选择热浸法作为提取方法。在热浸法中用水、稀乙醇为溶剂时浸出物的含量相对更高，但用水提取很难过滤，故提取溶剂选择稀乙醇。

3.2 薄层色谱条件考察

分别考察不同提取溶剂（乙醇30 mL、50%乙醇30 mL、70%乙醇30 mL 和浓盐酸3 mL、70%乙醇20 mL 和浓盐酸2 mL），不同提取方式（超声提取、加热回流提取），不同提取时间（1，2，3，4 h），不同点样量（供试品溶液1，2，3，4，5，6µL，对照品溶液1，2µL），不同展开剂［环己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶5∶0.8，V/V/V），甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1，V/V/V），甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10∶8∶1，V/V/V），甲苯- 乙酸乙酯- 甲酸（5∶4∶1，V/V/V）］，不同薄层板（硅胶H薄层板、聚丙烯酸钠硅胶G薄层板、羧甲基纤维素钠硅胶G薄层板）对槲皮素提取效果的影响，最终确定2.2 项下薄层色谱条件的提取效果较好，条带较清晰，能满足试验要求。

3.3 含量测定供试品溶液制备方法考察

槲皮素可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚等，参照《湖北省中药材标准（2018年版）》、2020年版《中国药典（一部）》中有关槲皮素含量测定方法及其他有关槲皮素含量测定的文献，考察甲醇和盐酸回流提取1 次及先用80%甲醇回流再用盐酸水解回流提取（回流2 次，第2 次稀释了2倍）对提取效果的影响，结果色谱峰无明显差异，但回流提取2 次的峰面积普遍更大，可能是由于先用80%甲醇提取再用盐酸水解，槲皮素提取更完全，故选择提取2 次。采用L9（34）正交试验考察取样量（0.5，1.0，1.5 g），甲醇体积分数（50%，80%，100%），回流时间（回流提取2 次，每次30 min，1 次1 h、1 次30 min，每次1 h），盐酸体积（3，5，7 mL）对提取效果的影响，结果样品取样0.5 g，甲醇体积分数80%，回流提取2 次，每次30 min，盐酸体积3 mL 时的效果最佳。根据槲皮素含量与浓度相同的对照品峰面积相比，取样0.5 g 时峰面积相对较小，为减小误差，最终确定样品取样1.0 g。故确定2.5.2项下供试品溶液制备方法。