高效液相色谱法同时测定益肺止嗽颗粒中7 种成分含量*

2023-10-17刘永昌王雪梅李喜香高丽霞

中国药业 2023年19期

刘永昌，王雪梅，李喜香△，高丽霞

（1. 甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000； 2. 甘肃省中医院，甘肃兰州 730050）

益肺止嗽颗粒由麻黄、杏仁、半夏、茯苓、甘草、陈皮、当归等15味中药材组方，具有宣肺和喘、祛痰止嗽等功效，用于治疗新咳久嗽、气喘痰多、慢性支气管炎等症。但目前益肺止嗽颗粒尚未建立质量标准，故本研究中根据不同药味的药理学作用和有效部位，结合君臣佐使的组方原则，选择君药麻黄中的有效成分盐酸麻黄碱、苦杏仁中的有效成分苦杏仁苷，臣药当归中的有效成分阿魏酸、黄芪中的有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷，以及在处方中起止咳化痰、祛痰止嗽功效的陈皮、莱菔子、甘草中的有效成分橙皮苷、芥子碱硫氰酸盐、甘草苷作为检测指标，建立同时测定这7 种成分含量的高效液相色谱（HPLC）法，以完善其质量控制标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2487型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XSE205型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为十万分之一）；MS07-MS30型数控超声波清洗器（深圳市德瑞超声波设备有限公司，功率为500 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

半夏（批号为200503），茯苓（批号为200321），麻黄（批号为211105），莱菔子（批号为210803），黄芪（批号为200321），甘草（批号为211121），地骨皮（批号为210726），桑白皮（批号为200218），陈皮（批号为200427），当归（批号为210316），苦杏仁（批号为210522），北沙参（批号为200321），川贝（批号为210917），前胡（批号为210507），紫苏子（批号为210511），均购自甘肃康乐药业有限责任公司，并由甘肃省中医院药学部李喜香主任中药师鉴定为正品，符合2020 年版《中国药典（一部）》相关规定；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号为J19HB174062，纯度为98%），甘草苷对照品（批号为Z07J12X136344，纯度为94.5%），盐酸麻黄碱对照品（批号为A21070585，纯度为98%），阿魏酸对照品（批号为L03A9D57744，纯度为99%），芥子碱硫氰酸盐对照品（批号为O27GB165515，纯度为98%），橙皮苷对照品（批号为K09S11L123847，纯度为98%），苦杏仁苷对照品（批号为Z28A6L2815，纯度为98%），均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Fun Fire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.15%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min 时5%A，5～15 min 时5%A →8%A，15～30 min时8%A，30～40 min时8%A →17%A，40～65 min时17%A →20%A，65～66 min 时20%A →5%A，66～71 min 时5%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：210 nm（0～36 min，盐酸麻黄碱、苦杏仁苷），326 nm（37～41 min，芥子碱硫氰酸盐），260 nm（42～53 min，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷），283 nm（54～71 min，橙皮苷）；柱温：25 ℃；进样量：10µL。

2.2 样品制备

按处方量称取黄芪、半夏、茯苓、甘草、地骨皮、桑白皮、陈皮、当归8 味药材，加10 倍量水提取2 次，每次96 min，得水提取液；按处方量称取苦杏仁、莱菔子、北沙参、川贝、前胡、麻黄、紫苏子7 味药材，加11 倍量66%乙醇，提取95 min，得乙醇提取液。将水提取液常压浓缩为清膏；乙醇提取液减压浓缩，回收乙醇至无醇味，合并水提取液清膏和乙醇提取液清膏，浓缩至相对密度为1.15～1.20 的稠膏，加入2 倍量的可溶性淀粉，制软材，60 ℃干燥2 h，过1 号筛和5 号筛，整粒，即得益肺止嗽颗粒。按此工艺制备3 批样品，批号分别为20220809，20220810，20220811。

2.3 溶液制备

混合对照品溶液：取7 种成分对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 分别含盐酸麻黄碱2.37 mg、苦杏仁苷1.322 mg、芥子碱硫氰酸盐0.548 mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.316 mg、阿魏酸1.314 mg、甘草苷0.374 mg、橙皮苷1.574 mg 的对照品贮备液；精密吸取对照品贮备液适量，用甲醇定容至5 mL，即得上述成分质量浓度分别为47.40，132.20，54.80，31.60，13.14，37.40，157.40µg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：取2.2项下样品颗粒适量，研细，取2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定质量，超声（功率为500 W，频率为40 kHz）处理30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按样品制备工艺制得缺黄芪、麻黄、甘草、苦杏仁、当归、莱菔子、陈皮的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.4 方法学考察

专属性试验：取2.3 项下3 种溶液各10 µL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相同保留时间处有相应峰，各成分均能达到基线分离（分离度＞1.5），且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.Ephedrine hydrochloride 2.Amygdalin 3.Glucosine thiocyanate 4.Ferulic acid 5.Piroisoflavone glucoside 6.Glycyrrhizin 7.Hesperidin A.Mixed reference solution B.Test solution C-I.Negative reference solution（lacking Ephedra Herba，Armeniacae Semen Amarum，Raphani Semen，Angelicae Sinensis Radix，Astragali Radix，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，Pericarpium Citri Reticulatae，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察与检测限、定量限确定：精密吸取2.3 项下对照品贮备液适量，用甲醇定容至5 mL，制成每1 mL 分别含盐酸麻黄碱2.37，4.74，7.11，9.48，47.4µg，苦杏仁苷6.61，13.22，19.83，26.44，132.2µg，芥子碱硫氰酸盐2.74，5.48，8.22，10.96，54.8 µg，毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.58，3.16，4.74，6.32，31.6µg，阿魏酸0.657，1.314，1.971，2.628，13.14 µg，甘草苷1.87，3.74，5.61，7.48，37.4 µg，橙皮苷7.87，15.74，23.16，31.48，157.4 µg 的对照品溶液，分别精密吸取10µL，按2.1项下色谱条件进样测定。以各成分的质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归［1］，得各待测成分的回归方程。分别以信噪比（S/N）为10∶1 和3∶1 时混合对照品溶液的质量浓度为定量限和检测限。结果见表1。

表1 7种成分的线性关系考察与检测限、定量限确定结果（n=5）Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LQD of seven components（n=5）

精密度试验：取2.3 项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定6次，记录峰面积。结果盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、芥子碱硫氰酸盐、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷峰面积的RSD分别为2.62%，1.25%，1.72%，0.48%，2.74%，0.71%，0.57%（n= 6）；取线性关系考察项下各成分最高、中间、最低3 个质量浓度的对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定3 d，结果各质量浓度对照品溶液日间精密度的RSD均小于3%（n=3），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20220809）样品6份，按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、芥子碱硫氰酸盐、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷含量的RSD分别为1.16%，0.54%，1.41%，0.76%，1.13%，2.18%，0.60%（n= 6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20220809）样品适量，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，16，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、芥子碱硫氰酸盐、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷峰面积的RSD分别为1.25%，0.16%，1.34%，1.79%，1.09%，1.12%，0.12%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知各成分含量的样品9 份，每份各2 g，精密称定，按80%，100%，120%分别加入适量混合对照品溶液，各3 份，按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.5 样品含量测定

取3批（批号分别为20220809，20220810，20220811）样品各适量，每批各3 份，按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果见表3。

表3 样品中各成分含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of each component in samples（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 指标成分选择

现代药理学研究表明，盐酸麻黄碱具有抗炎、平喘、松弛支气管平滑肌［2-3］等作用，苦杏仁苷具有镇咳平喘、抑制呼吸中枢［4-5］等作用，芥子碱硫氰酸盐具有舒张平滑肌、平喘作用［6-7］，橙皮苷具有抗炎、抗过敏、抗氧化［8］等作用，毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有抗菌、调节免疫力［9-10］等作用，阿魏酸具有抗菌消炎［11］、抗病毒等作用，甘草苷具有抗氧化、抗炎［12-13］等作用。故选取这7种成分为含量测定的指标成分。

3.2 色谱条件选择

在检测波长的选择上，本研究中首先在190～400 nm波长范围内对7种成分进行全波长扫描，确定其最大吸收波长，结合各成分的紫外吸收情况，最终选择切换波长的方式，以降低杂质对色谱峰的干扰，发现盐酸麻黄碱、苦杏仁苷在切换波长时会出现峰形变差的情况，在210 nm 波长处同时检测时，两者峰形较好，基线平稳；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷因出峰时间接近，在切换波长时出现峰形变差且阿魏酸未出峰的情况，于260 nm波长处同时检测时，3种成分吸收良好，峰形最佳。故最终选择盐酸麻黄碱、苦杏仁苷于210 nm 波长处同时检测，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷于260 nm 波长处同时检测，芥子碱硫氰酸盐于326 nm波长处检测，橙皮苷于283 nm 波长处检测。在同一信号的不同时间段设置不同检测波长，不仅能同时检测益肺止嗽颗粒中的7 种成分，还可缩短分析时间。在流动相的选择上，考察了乙腈- 0.1%磷酸溶液和乙腈-0.15%磷酸溶液，最终确定以后者作为流动相，梯度洗脱，此时各成分分离效果最好，无拖尾。

3.3 提取方法选择

在供试品溶液制备方法上，本研究中首先考察了超声、加热回流提取2 种不同的处理方法［14］，结果提取含量相当，故选择简单易操作的超声提取方法［15］；提取溶剂考察了甲醇和70%甲醇，结果以70%甲醇提取时，色谱峰峰形较差；提取时间考察了15，30，45 min［16］，最终确定为甲醇超声处理30 min，此时各成分峰形最佳，提取效率较高。