藕节对莲藕淀粉多酚含量的影响

王杰，刘延照，李洁，2，3，严守雷，2，3*，胡中立

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430070；2.湖北省水生蔬菜保鲜加工工程技术研究中心，湖北武汉 430070；3.长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，湖北武汉 430070；4.武汉大学生命科学学院，湖北武汉 430070）

莲藕（Nelumbo nuciferaG.）是我国种植的一种重要的水生蔬菜，主要分布于湖北、湖南、江苏等地区[1]。莲藕具有很高的营养价值，富含碳水化合物、矿物质、蛋白质、多酚等[2-3]。近年来天然植物多酚因其显著的抗氧化活性以及抑菌作用，成为国内外学者的研究热点。有研究表明，在常见的数十种蔬菜中，莲藕中的酚类物质含量较高[4]。孙杰等[5]研究发现莲藕中的多酚主要为没食子酸、儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、多巴、咖啡酸等。莲藕在加工和食用中可被分为去皮藕段、藕皮和藕节3 个部位，其中藕节的多酚含量高于藕皮和去皮藕段，具有更强的抗氧化活性[6]，但藕节通常被作为下脚料或废弃物。

莲藕淀粉是莲藕的重要传统加工产品之一，具有调理脾胃、补充气血、滋阴等功效，深受广大消费者青睐[7]。在莲藕淀粉的制作过程中需要经过匀浆的步骤，这其中涉及到细胞和组织的破坏，引起细胞内外酚类物质的释放。莲藕中的内源性酚类与莲藕淀粉相互接触并附着在其表面或者内部，形成结合态多酚[8]。目前结合酚的提取主要分为碱法提取（氢氧化钠溶液）和酸法提取（硫酸、盐酸）[9]。在淀粉中，酸法涉及高温会造成一部分酚类物质的损失，强酸则具有较大的腐蚀性使多酚发生水解；强碱会使淀粉严重糊化，无法正常提取淀粉中的结合酚[10]。冯芝英等[11]以糙米为原料，通过碱提法得到结合态酚粗提物。淀粉中的多酚研究目前较少，并只存在对游离酚的探究，牛鹏飞等[12]用乙醇浸提法和高效液相色谱法分析了橡子淀粉中的多酚组成，但是对于淀粉结合酚还未有研究报道。

目前人们对于莲藕淀粉的形态、生理功能研究较多[13]，但是对其多酚的存在形式、组分含量研究较少。本文以鄂莲5 号自制莲藕淀粉为试验材料，首次使用乙醇保护的碱提法对其多酚的存在形式、多酚组成以及影响多酚含量的因素进行研究，旨在揭示莲藕淀粉酚类物质的存在形式以及影响莲藕淀粉多酚含量的因素，为莲藕淀粉的工艺优化和莲藕淀粉功能活性的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鄂莲5 号鲜藕，2021年10月份采收于湖北武汉。

氢氧化钠、盐酸、乙酸乙酯、乙醚、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯）：美国Fisher 公司；没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素标准品（纯度均≥98.0%）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

MX-101SG1 搅拌机：日本Panasonic 公司；101-2B电热鼓风干燥箱：长葛市明途机械设备有限公司；ST 16R 高速冷冻离心机、Q ExactiveTMPlus 液相色谱质谱联用仪：美国Thermo Fisher 公司；KQ-600DB 数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；R-215 旋转蒸发仪：瑞士Büchi 有限公司；E2695 高效液相色谱仪：美国Waters 公司；EX30 生物显微镜：舜宇光学科技（集团）有限公司；LGJ-18 真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；FV3000 激光扫描共聚焦显微镜：日本Olympus 公司。

1.3 方法

1.3.1 莲藕淀粉以及藕节莲藕淀粉制备

将整支新鲜莲藕洗净切块，使用搅拌机以1 ∶3（g/mL）的料液比用水匀浆，过100 目纱布去渣，反复加水过滤，直至将藕渣内的浆液洗净为止。浆液加水沉淀3 次，弃上清液，4 500 r/min 离心15 min，得到离心杯底部白色的固体，刮去表层深色杂质。在电热鼓风干燥箱45 ℃恒温干燥，样品粉碎后，过100 目标准筛，筛下的淀粉为莲藕淀粉。

藕节莲藕淀粉制备时，材料为相同质量的整支莲藕与藕节，其余步骤同上述莲藕淀粉制备方法。

1.3.2 莲藕不同部位藕汁多酚制备

分别将藕节、藕皮、去皮藕段洗净切块，在搅拌机中以1 ∶3（g/mL）的料液比用水匀浆，过100 目纱布去渣，将滤渣反复加水过滤后合并滤液，10 000 r/min 离心10 min 取上清液，真空旋蒸浓缩至50 mL，用等体积乙酸乙酯和乙醚混合液萃取5 次，合并萃取液。于40 ℃旋蒸浓缩至干，将残渣溶于色谱甲醇中，超声使其完全溶解，并定容至5 mL，再用0.22 μm 有机微孔滤膜过滤，-20 ℃保存备用，即得到莲藕不同部位藕汁多酚。

1.3.3 激光扫描共聚焦显微镜

参考文献[14]的方法，样品在激光扫描共聚焦显微镜下进行观察，激发光源为488 nm 光栅处观察酚类物质的绿色荧光。

1.3.4 莲藕淀粉酚类化合物的提取

莲藕淀粉不同形态酚类化合物提取工艺参考文献[15]并进行优化，得到提取游离酚和结合酚的方法：

游离酚的提取：称取5.00 g 莲藕淀粉于离心管中，按1 ∶20（g/mL）的料液比，加入100 mL 70%乙醇溶液，室温下360 W 超声提取40 min，4 200 r/min 离心10 min后收集上清液，重复提取3 次，合并乙醇提取液，于40 ℃下旋蒸浓缩至干，将残渣溶于色谱甲醇中，超声使其完全溶解，并定容至10 mL，再用0.22 μm 有机微孔滤膜过滤，-20 ℃保存备用，此部分为游离酚。提取过游离酚的莲藕淀粉于电热鼓风干燥箱45 ℃恒温干燥，样品粉碎后，过100 目标准筛，以供结合酚的提取。

结合酚的提取：称取提取完游离酚的残渣5.00 g，加入200 mL 2 mol/L NaOH（溶剂为50%乙醇溶液），同时充入氮气，密封避光消化75 min。4 000 r/min 离心10 min 后收集上清液，用6 mol/L HCl 调节pH 值至2，于45 ℃条件下旋转蒸发去除乙醇，用等体积乙酸乙酯和乙醚混合液萃取5 次。将萃取所得有机相合并，于35 ℃旋转蒸发至干。超声使其完全溶解，并定容至5 mL，再用0.22 μm 有机微孔滤膜过滤，-20 ℃保存备用，该部分即为碱水解结合酚提取物。按照相同的方法处理标准品。

1.3.5 酚类物质分析方法

采用高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对多酚进行定性定量分析。色谱条件：XDB-C18 液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：0.4%甲酸；流动相B：乙腈；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm；进样量：10 μL；柱温：25 ℃。0～40 min（95%～75% A），40～50 min（75%～50% A），50～55 min（50%～30% A），55～56 min（30%～10% A），56～62 min（10% A），62～70 min（10%～95% A），70～75 min（95%A）。质谱条件参考文献[16]。

1.4 数据处理

试验所得数据采用Microsoft Excel 2016 进行基础统计处理，数据以平均值±标准差（n=3）表示，用SPSS 19.0 统计软件中的Duncan 检验进行数据显著性分析（P<0.05），使用Origin2018 绘图导出。

2 结果与分析

2.1 激光共聚焦显微镜分析

酚类物质的自体荧光特性使其在淀粉上的分布可以使用激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）观察[17]，结果如图1所示。

图1 莲藕淀粉CLSM 显微镜图Fig.1 CLSM images of lotus rhizome starch

由图1 可知，莲藕淀粉中可以观察到微弱的荧光，说明其含有酚类物质。藕节莲藕淀粉出现了明显的绿色荧光，并且多酚均匀地附着在淀粉的表面，说明在制作莲藕淀粉时藕节可以提高莲藕淀粉的多酚含量。

2.2 莲藕淀粉游离酚分析

多酚标准品HPLC 色谱图见图2，3 种标准品的回归方程见表1。

图2 多酚标准品HPLC 色谱图Fig.2 Chromatogram of polyphenol standard mixture

表1 3 种标准品的回归方程Table 1 Regression equations for three standard substances

由图2 和表1 可知，3 种标准品的出峰顺序为没食子儿茶素（10.05 min）、儿茶素（17.58 min）以及表儿茶素（22.63 min）。化合物的最大吸收波长与物质的结构有关，所以可以作为化合物紫外吸收特征之一，没食子儿茶素的λmax为269.8 nm，儿茶素和表儿茶素的λmax均为271.0 nm，因为儿茶素和表儿茶素是同分异构体，具有相同的官能团和共轭双键，有相同的能级结构，所以会表现出相同的最大吸收波长。通过保留时间以及最大吸收波长可以进行酚类物质的定性分析。3 种多酚的标准曲线相关系数R2均在0.999 以上，可以进行定量分析。

多酚标准品色谱图和回归方程如表2所示。

表2 莲藕淀粉游离酚含量Table 2 Content of free polyphenols in lotus rhizome starch μg/g

应用超声波技术辅助提取植物活性成分，可以缩短提取时间及有效提高效率[18]，但本次试验将莲藕淀粉用超声波辅助法无法提取出酚类物质，之前研究报道酚类物质与多糖可以通过共价键、氢键等形式结合[19]，结合比较紧密，可能是无法提出游离酚的原因。由表2可知，当提取淀粉时加入大量藕节后，莲藕淀粉中的酚类物质含量增加，可以提取出没食子儿茶素和儿茶素，但是含量很低，仅为7.22 μg/g 和3.76 μg/g。

2.3 莲藕淀粉结合酚分析

NaOH 溶液可以破坏淀粉分子内氢键，而且能够渗透到淀粉微晶结构内部促进淀粉颗粒中微晶束的解体[20]，所以在提取结合酚时添加NaOH 会破坏淀粉的结构，加快淀粉的糊化。在碱法提取结合酚中使用2 mol/L 的NaOH 溶液使淀粉悬浊液的黏度急剧增大，无法正常提取淀粉中的酚类物质。使用乙醇保护的碱提法提取莲藕淀粉中的结合酚时，莲藕淀粉的形态如图3所示。

图3 莲藕淀粉显微图（640×）Fig.3 Micrographs of lotus rhizome starch before and after alkali treatment（640×）

由图3 可知，碱处理前莲藕淀粉呈典型的椭圆形，碱处理后，莲藕淀粉仍然可以保持颗粒完整，不会发生明显的糊化。所以本试验中使用乙醇作为保护剂时，莲藕淀粉并未发生黏度急剧增大的现象，说明乙醇不仅可以作为酚类物质的溶剂，还可以保护淀粉不发生糊化。

在各种植物资源中，结合多酚的含量远高于游离多酚[21]，碱提法已经成为提取植物结合酚的主要方法。使用碱法提取多酚的方法处理没食子儿茶素标准品、儿茶素、莲藕淀粉以及藕节莲藕淀粉得到的色谱图见图4。

图4 碱提结合酚色谱图Fig.4 Chromatograms of polyphenols in different samples

由图4 A 可知，当没食子儿茶素标准品用碱提结合酚的方法水解后，没食子儿茶素水解为4 个特征峰，其中10.09 min 的出峰时间和正常没食子儿茶素的时间相似（图2），但是最大吸收波长变成了291.2 nm，说明碱性环境使没食子儿茶素的结构发生了变化[22]。由图4 B 可知，儿茶素经过碱回收后水解的碎片更多，其中有3 个峰（9.69、10.42 min 和22.60 min）的响应值和峰面积较大，将这3 个峰设定为儿茶素碱水解的特征峰。其中10.42 min 的出峰时间与没食子儿茶素相似以及最大吸收波长相同（图4A），说明儿茶素在碱的作用下生成和没食子儿茶素相同的物质。

由图4 C、D 可知，在莲藕淀粉的碱提结合酚中，均出现了与没食子儿茶素特征峰相同的峰，说明结合在莲藕淀粉上的酚类物质有没食子儿茶素。虽然无法绝对定量，但是从色谱图中峰的响应值和峰面积可以得到，藕节莲藕淀粉所含没食子儿茶素的量要明显高于普通莲藕淀粉，说明藕节对莲藕淀粉的多酚含量有很大的影响，与图1 荧光结果一致。同时在色谱图中均发现了与儿茶素峰相同的峰，说明结合在莲藕淀粉上的酚类物质还有儿茶素。在前期试验中发现酸法无法提出莲藕淀粉中的多酚，而碱法可以破坏酚类物质与细胞壁等其他物质的酯键和醚键[23]，说明莲藕淀粉中的多酚主要存在形式为酯键或醚键。

2.4 藕节汁酚类物质的定性分析

为了探究莲藕不同部位对莲藕淀粉多酚含量的影响，首先用HPLC-MS/MS 对制备莲藕淀粉时藕汁的酚类物质进行分析。藕汁酚类物质HPLC 色谱图以及LC-MS 总离子流色谱图见图5。

图5 藕汁酚类物质HPLC 色谱图和LC-MS 总离子流色谱图Fig.5 HPLC chromatogram and total ion chromatogram of polyphenols in lotus rhizome juice

使用提取的离子色谱图对酚类物质进行了定性分析，通过离子碎片以及查阅相关文献[24]，7 种多酚单体和7 种多酚低聚体，酚类物质鉴定结果见表3。

表3 负离子模式下LC-MS 对藕汁中主要多酚类质谱峰的鉴定结果Table 3 Main polyphenols in lotus rhizome juice identified by LC-MS in the negative ionization mode

由表3 可知，通过质谱鉴定出的酚类物质分别为没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、咖啡酸、表儿茶素、二氢杨梅素、槲皮素以及可能的原花青素低聚体。这些原花青素低聚体是以儿茶素或表儿茶素为单体构成，其中主要为B 型连接（C4-C8 或C4-C6）和A型连接（C4→C8、C4→C6 或C2→O7）混合构成[25]。原花青素是最有效的天然抗氧化剂之一，且与淀粉的相互作用也强于单体酚[26]。之前研究报道在莲藕中还检测到没食子酸、香豆酸，本研究结果与之略有差异。物候期是影响酚类总酚含量的因素之一[27]，所以结果的不同可能与莲藕的品种以及酚类物质提取方法的不同有关。

2.5 藕汁酚类物质定量分析

通过高效液相色谱定量检测了莲藕不同部位藕汁中没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素的含量，检测结果如图6 和图7，3 种酚类物质的出峰时间分别为10.3、18.1 min 以及23.1 min。

图6 莲藕不同部位藕汁的酚类物质色谱图Fig.6 Chromatograms of polyphenols in the juice samples prepared from different parts of lotus rhizome

图7 莲藕不同部位藕汁的酚类物质含量Fig.7 Content of polyphenols in the juice samples prepared from different parts of lotus rhizome

由图6 和图7 可知，藕节、藕皮和去皮藕段中均含有没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素3 种酚类，没食子儿茶素的含量明显高于其它两种。相对于莲藕湿重而言，藕节的没食子儿茶素含量为84.13 μg/g，为藕皮的2 倍、去皮藕段的5 倍。而谢君等[4]的研究发现去皮藕段的没食子儿茶素含量最高，可能是由于本研究中使用匀浆机破碎细胞时，使藕节中的没食子儿茶素大量释放。莲藕中含有大量水分，通过真空冷冻干燥得出去皮藕段和藕节的含水量约为85%，藕节的含水量为78.80%（图7B）。对于干重莲藕，藕节的多酚含量为565.14 μg/g，其含量明显高于藕皮和去皮藕段。无论是干重还是湿重，藕节汁的多酚含量均要显著高于藕皮和去皮藕段，此结果与研究报道[4]的结果一致。

食品加工往往涉及细胞和组织的破坏，从而引起胞内和胞外物质的释放。释放的内源性多酚与其他成分如淀粉、非淀粉多糖和蛋白质接触，对食品品质产生影响[28]。通过探究藕汁的多酚含量与种类，发现莲藕淀粉中的酚类物质很可能来源于匀浆时莲藕细胞释放的酚类物质与淀粉的相互结合，其中莲藕中含量最高的没食子儿茶素对其作用最大。由于藕节中的多酚含量最高，可以明显提高莲藕淀粉的多酚含量。

3 结论

本试验以莲藕淀粉和藕节莲藕淀粉为原料，分析了莲藕淀粉的游离酚和结合酚组成，以及藕节对莲藕淀粉含酚量的影响。结果表明，莲藕淀粉在乙醇保护下用NaOH 碱提结合酚，可以有效地预防淀粉发生糊化，结合酚的主要组分为没食子儿茶素，通过乙醇保护的碱提法为研究淀粉中的结合酚提供了新的研究思路。在制作莲藕淀粉时，莲藕会释放大量的酚类物质，藕节中酚类物质主要为没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素，其含量分别为565.14、263.59、21.50 μg/g（干重），其中没食子儿茶素的含量明显高于藕皮和去皮藕段。制作莲藕淀粉时增加藕节的含量可以明显提高莲藕淀粉多酚的含量。