双组分调控系统与细菌耐药性的关系及其抑制剂研究进展*

蔡杨,凌保东

(1.成都医学院药学院,成都 610500;2.成都医学院结构特异性小分子药物研究四川省高校重点实验室,成都 610500;3.四川省彭州市第四人民医院,彭州 611933)

双组分调控系统(two-component regulatory system,TCS)广泛存在于原核细胞中,是细菌感知和响应环境信号、调节生理行为最主要的机制,在细菌致病性、耐药性、生物被膜形成、毒力因子调控等方面均发挥着重要作用[1]。当细菌TCS感知和响应环境刺激时,是通过组氨酸激酶(histidine kinases,HK)和胞内的反应调节蛋白(response regulators,RR)使相关蛋白磷酸化来发挥调控作用[2]。细菌蛋白质磷酸化修饰是调控细菌基因表达的一种重要方式,也是药物作用的重要靶点。因此,靶向细菌TCS 抑制剂的开发成为新型抗感染药物研究的热点[3]。

1 TCS介绍

TCS是细菌、古细菌中最普遍的信号转导系统[1],在细菌中共发现TCS 1 000多种,平均一个细菌基因组可包含TCS编码基因50～60个,如铜绿假单胞菌编码TCS 60多个,大肠埃希菌编码TCS>30个,鲍曼不动杆菌中TCS有18个[4]。

1.1TCS 结构和功能 TCS通常由2种成分组成,即嵌入细胞膜中传感器HK和胞内RR[5]。HK接受环境的刺激,RR引起相应的生理改变[5],它们在细菌细胞中具有高度特异性[6]。HK由信号接收域和结构保守的催化核心组成,催化核心包括蛋白二聚体和组氨酸磷酸转移结构域(dimerization and histidine phosphotransfer,DHp) 和ATP 结合结构域[6]。RR由信号接收域和DNA结合的输出结构域组成[6]。

细菌TCS感知和响应环境刺激时,通过HK和RR使相关蛋白磷酸化来发挥调控作用。分为4个步骤:①HK检测外部环境或胞内/胞外生理性刺激,如渗透压或 pH 值;②HK催化DHp上保守的组氨酸发生自身磷酸化;③磷酸基团转移到同源RR接收结构域保守的天冬氨酸上;④磷酸化反应激活RR与特定DNA序列的结合,调节靶基因表达,实现对基因表达的控制[2,7]。许多HK也可以作为磷酸酶,使磷酸化的RR去磷酸化,从而可逆地控制基因表达。此外,复杂TCS信号传导需要通过多步磷酸化接力传递来完成信号传递[3]。HK磷酸化后,磷酸基团转移到胞内的一个接收结构域上,然后由组氨酸磷酸转移酶将磷酸基团转移至RR上,再引发信号输出,引起多种细胞生理变化[3]。在某些情况下,单个 HK 蛋白可具有多个同源 RR 蛋白,或单个 RR 蛋白可被多个 HK 蛋白激活[8]。为了更敏感地响应不同的环境变化,信息也在不同的 TCS之间传递,形成一个复杂的信号转导网络,各TCS相互作用、互相协调,感应外界环境并做出应答[7,9]。

细菌具有多个TCS,每个TCS响应特定的环境信号,如pH值、营养水平、渗透压、氧化还原状态、群体感应蛋白和抗菌药物[10],由此产生的细胞生理变化通常涉及激活细菌防御机制和增加抗菌药物耐药性[11],功能包括细胞生长、代谢调节、趋化性、毒力调节、群体感应、生物被膜形成和耐药性产生等[2]。

1.2TCS的种类

1.2.1必需的TCS WalKR TCS已被证明在革兰阳性菌(包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌和粪肠球菌)的生长中是必要的,功能主要为调节细胞壁代谢[12],但在革兰阴性菌(肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌)中必需的TCS笔者未见报道。见表1。

表1 TCS种类及生理功能

1.2.2非必需的TCS 除了涉及生长的TCS,大多数 TCS 对正常生长条件下的细菌存活不是必需的。细菌应对特殊压力环境的特定反应,如耐药性、毒力调节与生物被膜的形成都依赖于非必需TCS。各种TCS参与并调节致病菌的毒力因子,包括毒素的产生和分泌,对抗菌药物产生耐药性。其他重要的功能包括运动性、粘附宿主、定植和生物被膜形成等。见表1。

2 TCS与细菌耐药性的关系

2.1细胞表面修饰

2.1.1革兰阴性菌 TCS PhoPQ和PmrAB通过上调负责修饰细菌膜中脂多糖脂质A基因的表达,在多种革兰阴性菌(包括铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌等)的多粘菌素和抗菌肽的耐药性中起重要作用[4,18]。脂质A修饰包括加入4-氨基阿拉伯核糖或磷酸乙醇胺,可降低细胞膜的净负电荷,限制与阳离子抗菌药物(如多粘菌素)的相互作用。PhoPQ 可感知细菌胞外镁离子(Mg2+)、钙离子(Ca2+)和阳离子抗菌肽的存在,PmrB感知环境中弱酸性、低镁离子、铁限制等信号[19]。PhoPQ参与沙门菌中毒力的控制,且在铜绿假单胞菌的生物被膜形成和毒力中发挥作用[4,20]。PhoPQ不存在鲍曼不动杆菌中,PmrAB独立参与鲍曼不动杆菌对多粘菌素的耐药性[13]。肺炎克雷伯菌的PhoBR调节编码孔蛋白基因phoE表达下调,介导碳青霉烯类药物的耐药性[21]。

2.1.2革兰阳性菌 TCS VraSR能够对靶向细胞壁肽聚糖合成的抗菌药物迅速做出反应,感知细胞壁损伤,阻碍细胞壁合成基因的转录反应,导致β-内酰胺类和糖肽类抗菌药物耐药,并且调节细菌的毒力和生物被膜的形成[22]。VraS或VraR基因的缺失会使金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类药物和万古霉素重新敏感[23],并且在调节表皮葡萄球菌生物被膜的形成和对压力的耐受性中也起着重要作用[24]。WalKR不仅参与细胞壁合成的调控,还与lytM、atlA、ssaA和isaA基因的启动子区域特异性结合,正向调控自溶素和肽聚糖水解酶的表达,修饰细胞壁表面结构,增加万古霉素耐药性[12]。BraRS参与检测金黄色葡萄球菌细胞膜的破坏,对杆菌肽和乳链菌肽的耐药至关重要[22]。

2.2外排泵的过度表达 AdeRS是鲍曼不动杆菌中研究最深入的TCS之一。AdeRS中AdeR、AdeS或两者共同突变导致外排泵AdeABC过表达[25],介导鲍曼不动杆菌的替加环素耐药性[25]。当adeS失活,RND外排泵AdeABC显现下调而导致鲍曼不动杆菌对氨基苷类药物的敏感性增加[26]。根据转录组学数据,AdeRS控制近579个不同基因的表达[27]。此外,AdeRS也调控生物被膜的形成和表面运动相关功能[28]。鲍曼不动杆菌的TCS BaeSR通过上调外排泵基因adeA和adeB增加替加环素耐药性[29]。BaeSR 的缺失可导致主要外排泵 AdeABC、AdeIJK 和 MacAB-TolC 表达显著降低,增加鲍曼不动杆菌对替加环素和鞣酸的敏感性[30-31]。AdeRS 和BaeSR的耐药机制重叠,提示BaeSR可能通过与AdeRS发生串绕,共同调控基因表达[30]。CpxAR可以控制外排泵编码基因acrB、acrD和eefB的表达,与头孢吡肟和氯霉素耐药性有关[32];最新研究表明,当移动元件ISAba1插入BaeSR 基因后,外排泵基因(如macAB和adeIJK)表达增强,并介导鲍曼不动杆菌对多粘菌素的耐药[33]。

2.3激活耐药酶 铜绿假单胞菌中TCS CreBC激活染色体ampC基因,引发染色体β-内酰胺酶的过量产生,水解 β-内酰胺类药物[34]。GluSR突变也可以激活伯克霍尔德菌的β-内酰胺酶引起β-内酰胺类药物的耐药性[35]。PhoPQ 失活改变嗜麦芽窄食单胞菌外膜通透性,并增加β-内酰胺酶的流入,导致β-内酰胺类药物的耐药性[36]。气单胞菌中TCS BlrAB通过BlrB 感知肽聚糖损伤使BlrA磷酸化,导致几种β-内酰胺酶的激活,包括头孢菌素酶、青霉素酶和碳青霉烯酶[37]。AarG传感器激酶通过调节aac(2')-Ia基因,导致氨基苷类乙酰转移酶表达增加,与氨基苷类抗菌药物耐药性有关[38]。

2.4形成生物被膜 细菌生物被膜形成受TCS密切调控,TCS 控制生物被膜产生的关键成分以响应环境刺激,并最终触发细菌从浮游菌阶段转变为生物被膜菌阶段[39]。一旦形成生物被膜,细菌通过TCS或群体感应系统再次激活生物被膜内其他毒力基因[40]。铜绿假单胞菌多个TCS参与其生物被膜形成的整个过程,包括粘附-不可逆附着-聚集-成熟-解聚,涉及SagS、CreBC、GacSA等多个TCS[39,41-42]。SagS 激活 BrlR 上调MDR 外排泵,大大提高生物被膜的耐药性[41];CreBC直接感知青霉素结合蛋白4(PBP4),增加生物被膜的形成[42]。GacSA 通过与 RetS 和 LadS 的相互作用来控制sRNA、RsmY 和 RmsZ 的表达,将细菌急性感染转变为慢性感染[39]。除了调控生物被膜的形成,TCS在铜绿假单胞菌的运动性、毒素分泌和色素产生中都起重要作用。鲍曼不动杆菌通过激活BfmRS促进菌毛组装系统CsuA/BABCDE表达,合成菌毛粘附于生物/非生物的表面[43-44]。敲除BfmR后塑料上生物被膜形成的丧失,导致美罗培南和多黏菌素E耐药性上升。BfmS敲除后生物被膜形成受损,且减少Hcp蛋白的分泌[45],对氨曲南和多黏菌素敏感性降低[46]。GacSA在鲍曼不动杆菌中可以视为全局性调控剂,控制着多种基因的表达,包括毒力基因、菌毛、生物被膜形成以及运动性和芳香化合物代谢[39]。

3 TCS抑制剂

细菌TCS的主要调控方式是蛋白质磷酸化修饰,它既是调控细菌细菌诸多生命活动的一种重要方式,也是药物作用的重要靶点[9,47]。目前靶向细菌TCS的药物主要作用于TCS的HK-RR结构域而影响其生物学功能,涉及到的具体靶点主要有:①阻断HK对外部刺激的识别;②抑制HK磷酸化;③抑制ATP结合;④抑制RR磷酸化;⑤抑制RR与DNA结合[48]。根据TCS来源,将TCS抑制剂分为三大类:小分子化合物类TCS抑制剂、天然产物类TCS抑制剂和抗菌肽类TCS抑制剂。

3.1小分子化合物类TCS抑制剂

3.1.1靶向组氨酸激酶HK的抑制剂 迄今为止,大多数报道的TCS小分子抑制剂主要作用于TCS的HK。HK的催化结构域在TCS结构中保守度高,故大多抑制剂都以HK为靶点。最早在1993年报道的TCS抑制剂是合成的噻唑衍生物,可以同时抑制铜绿假单胞菌HK AlgR2活性和RR AlgR1与DNA结合活性[49]。环苯、苯并咪唑、苯并叶恶嗪、双苯等小分子化合物,不仅抑制HK,且影响细胞膜的完整性[48]。近年来以苯并噻唑为内核的小分子化合物成为研究热点,GOSWAMI等[50]通过高通量筛选鉴定的类似物riluzole-4 和riluzole-12通过阻断TCS GacS/GacA的信号影响RR GacA的表达降低喹诺酮类和吩嗪类等毒力因子的产生,并严重影响铜绿假单胞菌的运动性。THIELEN等[51]合成的2-氨基苯并噻唑类抑制剂在低Mg2+下抑制肠道沙门菌的生长,降低毒力基因pagC和pagK的表达,并减弱对多粘菌素B和多粘菌素E耐药性,使多粘菌素B和多粘菌素E的MIC降低至少16倍。

3.1.2靶向反应调节蛋白RR的抑制剂 相较于靶向HK,靶向RR最大的优势是直接控制基因表达,从而控制细菌的生理行为。在非同源HK-RR对之间可能发生不同程度的串扰,RR可以被来自另一个TCS的HK磷酸化,例如抑制同源HK会导致RR功能的不完全抑制[52]。TSAI等[53]鉴定的化合物Dephostatin通过SsrA-SsrB和PmrB-PmrA双组分调控系统干扰信号传导,可抑制沙门菌细胞内毒力因子并恢复多粘菌素的敏感性。TCS ArsRS对于幽门螺杆菌的酸适应和胃内定植至关重要,同时控制幽门螺杆菌主要毒力因子的表达,包括粘附因子和生物被膜[54]。

3.2天然产物类TCS抑制剂 近年来,发现越来越多的天然产物具有TCS抑制活性,很多天然药物中已经分离出包括酚类、黄酮类、萜类等多种具有TCS抑制活性的中药单体化合物[55]。ZHOU等[56]验证木犀草素对HK853蛋白自磷酸化活性的抑制作用,且木犀草素对HKS53的结合和抑制并非特异性,该作用可以推广到其他结构类似于木犀草素的黄酮类物质和TCS的其他HK蛋白。GONZALEZ等[57]证明7种天然类黄酮(包括木犀草素、山奈酚、槲皮素、杨梅素、芹菜素、白杨素和橙皮素)明显抑制HsrA的DNA结合活性,其中芹菜素、白杨素、山奈酚和橙皮素表现出对幽门螺杆菌的杀菌活性,白杨素与克拉霉素或甲硝唑组合表现出协同抗菌活性。两者的研究表明,黄酮类天然产物可作用于TCS不同靶点,进一步证明了黄酮类天然产物作为新型TCS抑制剂的潜力。

3.3抗菌肽类TCS抑制剂 抗菌肽对TCS的抑制主要表现为靶向胞内的RR受体和竞争性抑制HK。HO等[58]发现抗菌肽乳铁素B降低大肠埃希菌对环境刺激的耐受性,通过选择性结合RR受体结构域,抑制RR(BasR和CreB)及其同源HK(BasS和CreC)的磷酸化,表明抗菌肽可以直接影响TCS的磷酸化来抑制细菌的生长。能力刺激肽(CSP)是由肺炎链球菌分泌的 17 个氨基酸小分子肽。当CSP的浓度达到阈值时,CSP通过结合HK Com D ,激活RR ComE,导致毒力因子的表达[59]。经过化学修饰小分子肽可以竞争性抑制CSP,在肺炎链球菌肺部感染期间可有效地与HK ComD结合,抑制RR ComE调节基因的表达,降低了小鼠死亡率[60]。这种小分子肽可作为治疗肺炎球菌感染的新一代抗菌剂。

3种类型TCA抑制剂举例见表2。

表2 TCS抑制剂举例

4 结束语

细菌通过TCS的蛋白质磷酸化修饰方式调控细菌生命活动;可以通过干扰TCS通路来开发的新型抗菌药物 。按作用靶点分类,TCS抑制剂可以分为靶向HK和靶向RR以及同时靶向HK和RR的药物。靶向抑制HK活性的药物,可以减少磷酸基团的转移,影响细菌细胞膜产生;靶向抑制RR活性的药物,特异性强,直接控制基因表达;同时靶向抑制HK和RR的药物表现出高度的疏水性,生物利用度较差。由于TCS信号转导系统仅存在于原核细胞,开发的TCS抑制剂对人体细胞影响较小。通过靶向TCS来设计具有抗菌活性的小分子化合物抑制剂,研发周期长、投资大,目前尚没有小分子化合物被开发成为临床用药。天然产物便宜易得,且具有一定的抗菌活性,这一类TCS抑制剂可以作为联合用药治疗耐药菌感染,既增强抗菌药物的抗菌作用效果,还可较大限度地减少耐药性的产生。部分抗菌多肽也可以影响细菌的蛋白质磷酸化过程,可以作为TCS抑制剂。但天然抗菌肽存在体内的代谢稳定性差、活性普遍不高和存在细胞毒性等缺陷。针对耐药菌引起的感染,TCS抑制剂具有广阔的开发应用前景,与常规药物联合用药或将成为解决抗菌药物耐药性问题的新策略。