琥珀酸曲格列汀对糖尿病模型小鼠胆汁酸代谢的影响*

朵德龙,桓芝兰,赵妮,常亚娥,王亚峰

(青海省人民医院药学部,西宁 810000)

关键字 琥珀酸曲格列汀;磷酸西格列汀;胆汁酸;2型糖尿病

胆汁酸(bile acids,BAs)是胆固醇分解代谢的主要下游产物,在肝脏以胆固醇为原料合成,其合成有两条途径:一条是经典途径,由7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)催化;另一条是替代途径,由27α-羟化酶(CYP27A1)和12α-羟化酶(CYP8B1)催化,其中90%以上的胆汁酸通过经典途径合成[1]。CYP7A1作为胆汁酸合成的关键限速酶,其表达调控对于维持机体胆汁酸的稳态发挥重要作用[2]。胆汁酸一方面作为乳化剂促进小肠中脂类等物质的吸收及转运,同时也作为重要的信号分子与法呢醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)结合启动下游信号通路。FXR已被大量研究证实参与糖脂代谢、胆汁酸代谢、炎症及纤维化等病理过程[3-5]。研究表明,FXR可被胆汁酸激活,并通过小异二聚体伴侣(small heterodimer partner,SHP)的转录调控CYP7A1的表达[6]。另外,文献报道FXR/SHP信号通路在糖脂代谢中发挥重要作用,可调控微小RNA-802(microRNA-802,miR-802)的表达进而改善胰岛素抵抗[7]。琥珀酸曲格列汀是一种长效二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)抑制剂,每周口服一次,用于2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的治疗[8]。磷酸西格列汀是比琥珀酸曲格列汀上市早的DPP-4抑制剂,在临床应用比较成熟,效果确切,SCOTT等[9]报道口服磷酸西格列汀对肥胖、老年和肾脏受损等T2DM患者血糖控制疗效显著,大多数不良事件为轻度至中度,两药是否引起T2DM胆汁酸代谢的改变笔者未见报道。本次研究采用UHPLC-MS/MS胆汁酸高通量靶标定量检测技术测定小鼠回肠内容物中的69种胆汁酸的含量,探讨琥珀酸曲格列汀对T2DM胆汁酸代谢的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 db/db 雄性小鼠18只,为基因敲除的T2DM模型,体质量25～30 g;C57小鼠6只,体质量18～22 g,无特定病原体(SPF)级,均购自常州卡文斯实验动物有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2016-0010,实验动物合格证:202010621。各小鼠均分笼饲养,相对湿度40%～50%,饲养温度20～24 ℃,自由进食、进水。动物实验符合伦理学标准,并得到伦理委员会的批准。

1.2药品与试剂 琥珀酸曲格列汀(中国MCE,批号:1029877-94-8);磷酸西格列汀(中国MCE,批号:654671-77-9);Prime Script RT reagent Kit(宝日医生物技术有限公司,批号:RR047A);BCA蛋白浓度测定试剂盒(beyotime,批号:G2002-100ML);预染蛋白Marker(abclonal,批号:RM19001);CYP7A1抗体(abclonal,批号:A10615);FXR抗体(abclonal,批号:A8320);SHP抗体(abclonal,批号:A1836);生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(affinity,批号:s0001)。

1.3仪器与设备 实时荧光定量仪(Thermo Fisher Scientific公司,型号:QuantStudioTM3);热循环仪(美国ThermoFisher仪器有限公司,型号:TCA0096);电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司,型号:JY200C);全功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific 公司,型号:MK3);超高效液相仪(Thermo Fisher Scientific公司,型号:Vanquish);高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司,型号:Heraeus Fresco17)。

1.4动物分组与给药 将18只db/db小鼠按照随机数字表法分为模型对照组、琥珀酸曲格列汀组、磷酸西格列汀组,每组6只,C57小鼠6只为对照组。根据《药理实验方法学》中人与小鼠的等效剂量换算[10],琥珀酸曲格列汀组给药剂量为17.29 mg·kg-1,每周1次;磷酸西格列汀组给药剂量为16.71 mg·kg-1·d-1,连续给药8周。处死小鼠,取肝脏、胰腺、肾脏和回肠,称质量后-80 ℃保存,保存的组织应避免反复冻融。

1.5苏木精-伊红(HE)染色评估组织病理 参照文献[11-12]方法,用无菌水冲洗组织1～2 h,甲醛固定胰腺和肾脏,用乙醇溶液梯度脱水,孵育。用石蜡包埋组织,切片后,HE色,观察具体病变,并根据SCHMIDT等[13-14]建立方法对小鼠胰腺和肾脏组织病理学评分。

1.6实时聚合酶链反应(real-time PCR)测定CYP7A1、FXR和SHP的mRNA水平 参照文献[15]方法,以β-actin为内参,根据总RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA。逆转录反应后置于PCR仪上进行扩增,按照PCR扩增试剂盒进行操作,测定CT值,采用2-△△CT法计算mRNA表达水平。所用引物见表1。

表1 所用引物及碱基序列

1.7Western blotting测定CYP7A1、FXR和SHP的蛋白水平 参照文献[16]方法。使用RIPA裂解液裂解细胞,提取总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。每组样品各取蛋白质50 μL,经电泳分离后转到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。将PVDF膜与一抗孵育:CYP7A1 1：2 000;FXR 1：2 000;SHP 1：2 000;β-actin 1：50 000,随后与生物素化山羊抗兔IgG(H+L)二抗孵育。孵育后,用ECL发光液孵育印迹,曝光扫描,结果以目的蛋白相对表达量表示。

1.8超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法联合胆汁酸高通量靶标定量检测小鼠回肠内各种胆汁酸的含量 称取回肠样本25 mg,加入提取液(甲醇：乙腈：水=2：2：1)1 000 μL,涡旋混匀30 s。然后,加入钢珠,40 Hz研磨处理4 min,超声5 min,重复以上步骤3次,随后-40 ℃静置1 h。最后,将样品在4 ℃,13 778×g离心15 min,取上清液进样,用于UPLC-MS/MS分析。色谱相条件:色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm),流动相A相为5 mmol·L-1乙酸铵溶液(pH值= 8),B相为乙腈。柱温为45 ℃,样品盘设为4 ℃,进样体积为1 μL。质谱条件:以平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)模式进行质谱分析。离子源参数:雾化压=+3 500/-3 200 V,鞘气(N2)流速 40 L·min-1,辅助气(N2)流速=15 L·min-1,扫气(N2)流速=0,辅助气(N2)温度350 ℃,进样毛细管温度320 ℃。

2 结果

2.1病理状态 模型对照组胰岛轻微萎缩,胰岛细胞变性坏死,细胞核固缩;琥珀酸曲格列汀组则出现少量胰岛细胞萎缩和变性坏死,其他未见明显病理变化;磷酸西格列汀组也出现少量胰岛萎缩和变性坏死,其他未见明显病理变化。模型对照组肾小球内基质增生,肾小管变性坏死,胞质溶解,部分细胞胞核固缩或裂解;琥珀酸曲格列汀组磷酸西格列汀组出现肾小球基底膜增厚和肾小管上皮细胞变性坏死。根据胰腺和肾脏组织病理评分,琥珀酸曲格列汀组胰岛萎缩及其细胞变性坏死和肾小球基底膜增厚以及肾小管上皮细胞变性坏死评分低于模型对照组。上述结果提示琥珀酸曲格列汀可减轻T2DM的胰腺和肾脏组织病理状态。见图1。

Con:对照组;Mod:模型对照组;Tre:琥珀酸曲格列汀组;Sit:磷酸西格列汀组。①与对照组比较,t=3.279～6.000,P<0.05。

2.2对肝脏CYP7A1、FXR和SHP表达的影响 结果见图2。与模型对照组比较,琥珀酸曲格列汀组和磷酸西格列汀组CYP7A1 mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义;琥珀酸曲格列汀组FXR mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而磷酸西格列汀组对FXR mRNA和蛋白表达水平变化不显著;琥珀酸曲格列汀组对SHP mRNA和蛋白表达水平有升高趋势,但差异无统计学意义,磷酸西格列汀组SHP mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义。

Con:对照组;Mod:模型对照组;Tre:琥珀酸曲格列汀组;Sit:磷酸西格列汀组。①与模型对照组比较,t=-3.838,-8.102,P<0.05;②与对照组比较,t=2.322～18.424,P<0.05。

2.3琥珀酸曲格列汀对胆汁酸代谢组学的影响

2.3.1数据采集和预处理 所有质谱检测数据由Orbitrap Exploris 120进行采集,峰识别、鉴定、降噪以及归一化处理后,从中提取代谢物69个。为更好地分析数据,对原始数据进行一系列的准备和整理,对单个代谢物进行过滤,只保留单组空值不多于50%或所有组中空值不多于50%的代谢物数据。对原始数据中的缺失值进行模拟数值,经过预处理后48个代谢物被保留。

2.3.2主成分分析 使用SIMCA软件(V16.0.2),对数据进行对数(LOG)转换加UV格式化处理,然后进行自动建模分析,主成分分析(principal component analysis,PCA)得分图中横坐标PC1和纵坐标PC2分别表示排名第一和第二的主成分的得分,每个散点代表一个样本,散点的颜色和形状表示不同的分组,样本基本处于95%置信区间。采用PCA主成分分析法对回肠样本各组的分布趋势进行预测,见图3。由图3可见,与对照组比较,模型对照组较明显,表明小鼠回肠中胆汁酸代谢发生改变。琥珀酸曲格列汀组有60%小鼠回肠样本可与模型对照组分离,磷酸西格列汀组有80%的小鼠回肠样本可与模型对照组分离,表明琥珀酸曲格列汀和磷酸西格列汀可逆转小鼠回肠胆汁酸代谢的改变。

Con:对照组;Mod:模型对照组;Tre:琥珀酸曲格列汀组;Sit:磷酸西格列汀组。

2.3.3筛选对照组与模型对照组有差异的胆汁酸 图4A显示,对照组和模型对照组小鼠回肠样本在有监督的正交偏最小二乘-判别分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA)得分图中分离明显;图4B显示,对回肠样本的OPLS-DA得分图模型进行200次置换检验,得到对照组和模型对照组的R2Y和Q2的回归线,其与纵轴的截距分别为0.35,-1.17,

Con:对照组;Mod:模型对照组。

说明原模型具有良好的稳健性,不存在过拟合现象。利用OPLS-DA分析方法过滤掉不相关的杂乱数据,采用OPLS-DA模型得到的VIP值(variable importance in the projection)大于1的胆汁酸,结合统计分析(P<0.05)以及变化趋势共预测12种差异胆汁酸,见表2。

表2 模型对照组和对照组之间的差异胆汁酸

2.3.4琥珀酸曲格列汀对差异胆汁酸的影响 将对照组、模型对照组、琥珀酸曲格列汀组和磷酸西格列汀组小鼠回肠的48种胆汁酸和12种差异胆汁酸进行可视化热图分析,见图5。与对照组比较,模型对照组小鼠回肠中有8种胆汁酸水平显著上调,包括去甲胆酸(nor cholic acid,NCA)、猪脱氧胆酸(hyodeoxycholic acid,HDCA)、α-鼠胆酸(α-muricholic acid,αMCA)、牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)、牛磺猪去氧胆酸(taurohyodeoxycholic acid,THDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)、牛磺脱氧胆酸(taurodeoxycholic acid,TDCA)、牛磺α-鼠胆酸(tauro α-muricholic acid,TαMCA);有4种胆汁酸下调,包括脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)、7-酮基去氧胆酸(7-ketodeoxycholic acid,7-ketoLCA)、甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid,GDCA)、胆酸-3-硫酸(cholic acid-3-sulfate,CA-3S)。与模型对照组比较,琥珀酸曲格列汀组和磷酸西格列汀组可回调部分差异胆汁酸。通过观察给药后胆汁酸的回调个数和回调程度,可直观反映琥珀酸曲格列汀和磷酸西格列汀对2型糖尿病小鼠回肠胆汁酸的作用,结果见图6。与模型对照组比较,琥珀酸曲格列汀组可显著下调4种胆汁酸,包括NCA、HDCA、THDCA和αMCA,可显著上调TCDCA;与模型对照组比较,磷酸西格列汀组能显著下调6种胆汁酸,包括NCA、HDCA、THDCA、αMCA、TDCA和TαMCA。

Con:对照组;Mod:模型对照组;Tre:琥珀酸曲格列汀组;Sit:磷酸西格列汀组。

Con:对照组;Mod:模型对照组;Tre:琥珀酸曲格列汀组;Sit:磷酸西格列汀组。①与对照组比较,t=-9.963～-2.127,P<0.05;②与模型对照组比较,t=2.431～4.712,P<0.05。

3 讨论

BAs除从肝脏合成外,还可从末端回肠重吸收,正常情况下从肝脏合成的BAs仅占胆汁酸池的5%,约95%的BAs需从胆汁释放入回肠末端经肝脏门静脉重吸收,以满足自身需求和保持BAs的稳定[17]。FXR是一种细胞内信号蛋白,在肝脏、肠、肾上腺和肾脏等组织高表达,对维持BAs稳态至关重要,在体内外实验表明,BAs可通过作用于FXR途径来影响宿主的生理机能[18-20]。

琥珀酸曲格列汀通过抑制肠道中分泌的DPP-4,从而减少胰高血糖素样肽-1的失活,促进胰腺分泌糖依赖性胰岛素而治疗T2DM[8]。CHEN等[21]证实四妙丸可改变T2DM的胆汁酸谱而激活FXR。在本次研究中发现主要有 12 种可能与 T2DM 相关的胆汁酸发生变化,琥珀酸曲格列汀可显著回调部分差异胆汁酸且增加FXR和SHP表达,提示琥珀酸曲格列汀通过抑制DPP-4的同时可能通过调控胆汁酸代谢协同发挥降糖作用。此外,本实验结果显示db/db小鼠胰岛有不同程度的萎缩、变性和坏死,这与孔晓妮等[22]研究一致,并发现琥珀酸曲格列汀可改善胰腺组织病理状态。

有研究表明,NCA可通过负调控肝细胞中的FXR/SHP信号通路,TαMCA是天然的FXR拮抗剂,它们均可降低FXR和SHP的表达[23-24]。也有研究证实HDCA、CDCA、DCA、CA、LCA及其与甘氨酸和牛磺酸的偶联物是FXR内源性激动剂[25-27]。本研究发现琥珀酸曲格列汀可显著下调NCA和 αMCA,显著上调TCDCA,这可能是FXR和SHP表达升高的原因,而磷酸西格列汀显著下调 NCA、αMCA 和TαMCA,同时又下调了 HDCA、THDCA 和 TDCA,所以未能增加 FXR 和 SHP 的表达。研究证实高血糖可诱导系膜细胞分泌MCP-1,继而引起TNF-α、MCP-1、IL-6等炎症因子表达增加,激活NF-κB信号通路,它的激活可进一步诱导MCP-1、ICAM-1等炎症分子的高表达,促进糖尿病肾病的进展[28-31]。ZHANG等[32]研究证实FXR激动剂WAY-362450在非酒精性脂肪肝模型中可显著减少TNF-α、IL-6等炎症因子的表达。WANG等[33]证实FXR激动剂INT-747治疗可减少蛋白尿、肾小球硬化和肾小管间质纤维化并可改善肾脏组织病理状态。研究表明琥珀酸曲格列可改善IL-1β诱导的氧化应激和促炎因子TNF-α、IL-6的产生,并能降低NF-κBp65的表达水平[34-35]。糖化血红蛋白作为血糖控制的金标准和评估并发症发生风险的指标,根据先前的研究,琥珀酸曲格列汀可降低血清中糖化血红蛋白的浓度,且可改善肾脏组织病理状态,提示琥珀酸曲格列汀可能通过激活FXR对糖尿病肾病产生保护作用,后续将在糖尿病肾病模型中深入探讨琥珀酸曲格列汀对糖尿病肾病的保护作用。

本研究应用靶向胆汁酸代谢组学的方法和思路,发现琥珀酸曲格列汀可调控T2DM的胆汁酸代谢,但未研究琥珀酸曲格列汀不同剂量以及其对健康小鼠胆汁酸代谢的影响,将在后续的研究中进一步探讨。另外,胆汁酸代谢涉及的生理机制和疾病领域广泛而复杂,本次研究仅涉及FXR、SHP、CYP7A1的表达以及69种胆汁酸含量变化,有待更深入、更全面的研究。