养阴益气胶囊长期毒性实验

唐颖馨,姚达宝,聂璐薇,刘娜

(华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉 430030)

随着人口的增长和老龄化,脑卒中成为全球人类致残和死亡的第2大原因[1]。糖尿病是脑血管病危险因素之一,约1/3脑卒中患者同时患有糖尿病,伴发糖尿病的脑卒中患者预后较差[2]。预防糖尿病、管理好糖尿病患者的血糖,对降低脑卒中的发生率、改善脑卒中患者的预后具有重要的临床意义[3-5]。糖尿病属于中医的消渴病范畴[6],其治疗需针对病因病机,抓住阴虚为本的实质,以气阴两虚为主要治疗对象,并兼顾阳虚与血瘀的治疗为纲[7-8]。养阴益气胶囊则是针对这一治法治则而开发的中药新药,处方组成为黄芪、葛根、山楂、绞股蓝、天花粉、葫芦巴,以“益气养阴为主,兼及温阳与活血”为治则,增强养阴之力,又改善脾胃之功,具有益气养阴,兼顾治疗阳虚与血瘀的作用,对上、中、下三消的病证有明确的功效。从单味药材来看,本品大部分药材均具有一定的降血糖作用[9-12],由于伴发糖尿病的脑卒中患者多有阴虚与血瘀表现,因此养阴益气胶囊对于脑卒中伴糖尿病患者的疗效可能更好。养阴益气胶囊作为中药新药,尚处于临床前研究。因本品内容物含有较多的辅料,开展毒理实验时,采用最大灌胃量给药也无法达到足够的毒性考察剂量,故本研究采用其浸膏进行灌胃给药,以提高给药量,连续给药6个月来考察本品的长期毒性[13],以确定其安全剂量,为产品临床安全应用提供支撑。

1 材料与方法

1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级SD大鼠90只,6～8周龄,雌雄各半,雌性体质量(146.9±8.9)g,雄性体质量(171.4±13.4)g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(合格证号:医动字19-008)。大鼠按性别分笼饲养,每笼5只,适应性饲养1周,自由进水,保持室温(25±2)℃,相对湿度55%～60%,12 h光照/12 h黑暗;大鼠喂养饲料(玉米73.5%,麦麸20%,鱼粉5%,谷粉1%,食盐0.5%)由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.2药物与溶媒 养阴益气胶囊浸膏(浸膏1 g相当于生药6.64 g),由健民药业股份有限公司提供,每瓶400 g,批号:980920。溶媒为纯化水,临用前配制成不同浓度的混悬液。

1.3仪器 PRACTUM612-1CN电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司,感量:10 mg],XT-2000i全自动血球计数仪[希森美康生物科技(无锡)有限公司],AU680型全自动生化分析仪(贝克曼库尔特有限公司),DM2500光学显微镜(德国徕卡公司)。

1.4动物分组与给药 动物经适应性饲养1周后,按随机数字表法将90只大鼠随机分为养阴益气胶囊大剂量组、小剂量组和空白对照组,每组30只,雌雄各半。养阴益气胶囊大剂量组:每日灌胃给药剂量为相当于生药20 g·kg-1,相当于临床日拟用量的60倍;养阴益气胶囊小剂量组:每日灌胃给药剂量相当于生药5 g·kg-1,相当于临床日拟用量的15倍;空白对照组:每日灌胃等容量的纯化水。各组均每日上午灌胃给药1次,灌胃容量均为5 mL·kg-1;给药剂量根据每周体质量测量的结果进行调整;给药时间均为180 d。给药第90天时,处死大剂量组和空白对照组动物各10只,用于中间剖检,以观察灌胃90 d后动物是否存在明显毒性作用;给药第180天时,处死空白对照组和大剂量组动物各10只,小剂量组20只;其余动物停药观察2周后处死,处死前称定体质量。

1.5动物基本情况观察 实验期间,每日观察大鼠外观体征、进食、行为活动、排便等情况;每周测量体质量1次,统计分析每4周体质量增长量。

1.6血液学指标检测 动物处死后,取全血检测红细胞计数、血红蛋白定量、白细胞计数及分类等。

1.7血液生化指标检测 动物处死后,取全血,检测丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、血糖(glucose,Glu)等。

1.8病理检查 ①系统尸检:全面检查各组织器官的大小、形态、颜色、质地、有无出血、淤血、渗出等病理变化。②脏器系数:大鼠处死前称定体质量,取出心、肝、脾、肺、肾、胃、肾上腺、脑垂体、甲状腺、卵巢、睾丸等组织后,立即用滤纸吸干表面水分,称定质量,计算脏器系数。③组织学检查:10%甲醛(福尔马林)溶液固定,石蜡包埋切片,苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察。

1.9可逆性观察 给药180 d后,每组均留大鼠10只,于停药后继续观察2周再处死,各项检测指标同前。

2 结果

2.1对动物基本情况的影响 3组大鼠实验期间和停药2周后,外观体征和行为活动未见异常,大鼠活动自如,毛发整齐而有光泽,粪便呈颗粒状;养阴益气胶囊大、小剂量组大鼠体质量增加,与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),大鼠体质量增长情况见表1。

表1 3组大鼠不同给药时间体质量增长情况比较

2.2对血液学指标的影响 3组大鼠连续灌胃给药180 d后,养阴益气胶囊小剂量组和大剂量组血液学指标均在正常范围内[12],与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);停药2周后,养阴益气胶囊小、大剂量组血液学指标均在正常范围内,与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 3组大鼠给药180 d和停药2周后血常规指标比较

2.3对血生化指标的影响 养阴益气胶囊连续灌胃给药180 d后,养阴益气胶囊大剂量组BUN高于空白对照组(P<0.05),但仍在正常范围内[14];其余血生化指标各组间比较差异无统计学意义(P>0.05);停药2周后,与空白对照组比较,养阴益气胶囊小剂量组、大剂量组血液生化指标差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 3组大鼠给药180 d和停药2周后血生化指标比较

2.4对脏器系数的影响 系统尸解发现,给药180 d和停药2周,3组大鼠各组织器官的大小、形态、颜色、质地等均未见异常,无水肿、出血、渗出等变化。养阴益气胶囊连续灌胃给药180 d和停药2周后,与空白对照组比较,养阴益气胶囊小剂量组、大剂量组各脏器系数及生殖腺系数均差异无统计学意义(均P>0.05),见表4。

表4 3组大鼠灌胃180 d和停药2周后脏器系数和生殖腺系数比较

2.5组织病理学检查 空白对照组及大剂量组有个别动物肝细胞有轻度水样变性,2组间有轻度水样变性的细胞,数量差异无统计学意义(P>0.05),其他未见明显病变,见图1。

图1 3组大鼠给药180 d肝脏组织病理图(HE,×100)

3 讨论

药物养阴益气胶囊经过长期灌胃给药(6个月)后毒性情况研究结果显示,安全性总体良好,部分异常数据主要集中在血生化指标,如大剂量组大鼠BUN水平高于空白对照组,但仍在正常范围内,且大剂量相当于临床用药剂量的60倍,小剂量组大鼠则未出现BUN增高的情况。此外,停药2周后观察,大剂量组大鼠BUN已恢复正常,表明大剂量药物所致BUN异常在停药后可逆,且临床拟用量远小于该剂量,故综合来看,大鼠灌胃养阴益气胶囊6个月,生药安全剂量20 g·kg-1,且该剂量相当于临床拟用量的60倍,整体安全性较好。

按照相关指导原则[13],中成药因受制于制剂因素,在开展毒理学实验,尤其是急性毒性实验与长期毒性实验时,一般会采用浸膏进行给药,目的是能给予足够大剂量,以充分暴露产品毒性情况。因此,浸膏作为中成药所有物质成分的集合物,基本可以代替成品制剂进行毒理学研究,且相对于成品制剂而言,更能发现产品的毒性作用。而与本文浸膏所混合的辅料均为国家认可的无活性物质,并不会影响药物安全性的评价。

当然,本研究仍存在一定的不足,由于本品的有效成分及其检测方法研究尚需改进,未能伴随毒动学研究,尚不能从物质基础角度探索本品的安全性情况,仅通过动物行为表现、相关生理指标来反映。为此,后续将进一步通过脑卒中伴糖尿病动物开展PK-PD模型研究,以更加全面、深入地探索本品疗效与安全性。