眼表定植菌群分布特征及常见菌耐药性分析

陈 宇,赵 雅,,王 林

(1.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046;2.西安市第一医院检验科,陕西 西安 710002)

眼表是位于上下眼睑缘灰线之间的眼球表面的全部黏膜上皮,包括角膜上皮、结膜上皮、泪器、泪道等[1]。眼表本身存在一个相对稳定的微环境,能够刺激机体启动免疫应答对抗病原菌入侵,成为眼表抗炎防线的主力军[2]。眼表菌群处在一种动态平衡中,在某些内外界因素(包括衰老、佩戴隐形眼镜、植入角膜假体、局部使用抗生素等)的干扰下,这种平衡状态会被打破,导致定植在眼表的细菌进入眼内大量增殖[3],继而成为感染性眼病的主要病原菌。眼部发生感染会给眼球组织带来损伤,损害视觉功能和严重影响心理健康。因此,明确眼表常见定植菌群分布并且有针对性的应用抗生素对治疗眼部感染至关重要。本研究收集西安市第一医院2021年7月至2022年9月健康体检人群眼结膜囊标本共93例,通过对眼表定植菌群分布特征及常见细菌抗生素耐药性进行分析,为临床眼部感染的早期经验用药提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取西安市第一医院2021年7月至2022年9月93例健康体检人群作为研究对象,其中男45例,女48例。纳入标准:所有研究对象过去一个月未使用抗生素、无泪道炎、泪囊炎、睑缘炎等眼部疾病、无干燥综合征、糖尿病等影响眼表的全身性疾病;研究对象对本研究均知情同意。标本由西安市第一医院眼科医师收集后送至检验科微生物室进行细菌培养、鉴定及体外药敏试验。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器与试剂:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(德国布鲁克公司),Vitek 2 Compact 全自动细菌药敏分析仪(法国生物梅里埃公司),Vitek 2 配套药敏卡GP67药敏板卡(最低抑菌浓度MIC法),37 ℃二氧化碳培养箱,培养基为哥伦比亚血平板、巧克力平板(郑州安图公司),聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增仪(美国Bio-Rad公司),电泳仪(北京六一仪器厂),Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物有限公司),2×HieffTM PCR Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司),耐药基因分子检测阴性对照菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923,阳性对照菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213购自美国标准菌库ATCC。

1.2.2 细菌培养及鉴定:严格遵循《全国临床检验操作规程》操作指导,将采集的标本接种在哥伦比亚血平板培养基、巧克力琼脂培养基中,置于35 ℃二氧化碳恒温培养箱中培养24～72 h。根据细菌菌落特点和革兰染色结果进行初步鉴定,再采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行细菌鉴定。

1.2.3 药敏试验:采用VITEK 2 Compact全自动药敏分析仪进行药敏试验,结果判定严格按照美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的标准执行。

1.2.4 mecA基因检测:将收集冻存的菌株常温复苏,接种于血琼脂平板上,过夜孵育。采用生工Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA提取,引物交由上海生工生物有限公司设计合成,上游引物:5’-ACGAAGAATATAATAAATTAACCGAA-3’,下游引物:5’-GATTTGCCAATTAAGTTTGCAT-3’。反应体系共20 μl:DNA模板1 μl,上、下游引物各1 μl,Master PCR Mix 10 μl,ddH2O 7 μl。热循环参数:95 ℃预变性4 min;94 ℃变性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环;72 ℃终延伸10 min。试验分别采用金黄色葡萄球菌ATCC29213和ATCC25923标准菌株作为阳性对照和阴性对照。扩增产物通过2.0%琼脂糖凝胶100 V电泳30 min,最终在凝胶成像系统上观察结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件进行分析,计数资料以[例 (%)]表示,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结膜囊标本所分离的细菌分布和构成比 对93例健康体检人群结膜囊标本经培养,87例培养阳性,阳性率93.55%,其中39例培养出一种细菌,剩余48例培养出两种或两种以上细菌。共分离出168株细菌,G+菌150株(89.29%),G-菌15株(8.93%),真菌3株(1.79%)。具体菌株分布结果见表1。

表1 87例眼部结膜囊标本的细菌分布和构成比(n=168)

2.2 主要革兰阳性球菌耐药情况 所分离的主要凝固酶阴性葡萄球菌(表皮葡萄球菌、人葡萄球菌)对多种抗生素呈现出耐药性,未发现对莫西沙星、利福平和万古霉素耐药的菌株,75株凝固酶阴性葡萄球菌有39株为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(Methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococci,MRCoNS),占52.00%(39/75)。主要革兰阳性球菌耐药情况,见表2。

表2 眼部常见革兰阳性球菌耐药情况

2.3 MRCoNS与MSCoNS两组耐药率比较 MRCoNS对抗生素的耐药率明显高于甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌(Methicillin-susceptible coagulase-negative staphylococci,MSCoNS),其中青霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、复方新诺明五种药物耐药率差异有统计学意义(均P<0.05),见表3。

表3 MRCoNS与MSCoNS耐药率比较[例(%)]

2.4 眼部和同期其他部位所分离凝固酶阴性葡萄球菌耐药率比较 统计药敏结果显示,非眼部所分离的凝固酶阴性葡萄球抗生素耐药率及MRCoNS所占比例总体高于眼部分离株,两者耐药率均较高的抗生素有青霉素、克林霉素和红霉素。两组对喹诺酮类药物、庆大霉素、复方新诺明耐药率差异有统计学(均P<0.05)。见表4。

表4 眼部和非眼部葡萄球菌耐药率比较[例(%)]

2.5 耐药基因mecA检测结果 耐甲氧西林耐药基因mecA经PCR扩增出664 bp大小的DNA片段,对75株凝固酶阴性葡萄球菌mecA基因进行检测,结果显示40株mecA基因阳性,其中39例与Vitek 2 Compact全自动细菌药敏分析仪苯唑西林耐药所预测的MRCoNS一致,1例与仪器检测结果显示的苯唑西林敏感不符,符合率为97.5%。剩余35株菌株mecA基因阴性,与仪器所检测的苯唑西林敏感均相符。试验所设立的阴阳对照结果与预期一致,耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌mecA耐药基因PCR产物电泳图见图1。

1～4:mecA阳性菌株;5:阳性对照;6:阴性对照

3 讨 论

眼表核心微生物群是由凝固酶阴性葡萄球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌等革兰阳性菌为主的多种细菌共同组成。凝固酶阴性葡萄球菌是定植在人体皮肤黏膜上一种常见的条件致病菌,也是泪囊炎、结膜炎术后眼内炎等感染性眼病的主要致病菌[4-7]。在本研究中,结膜囊标本培养阳性率是93.55%,高于国内外报道的正常结膜囊样本中细菌检出率为20.60%～87.00%的水平,造成这种差异可能与培养时间、纳入研究对象的标准及地理位置不同有关。在眼部定植菌分布特征方面,我们的研究结果与国内外其他一些研究结果基本一致[8-9],葡萄球菌是眼表主要定植菌,革兰阴性菌在我们的研究结果中占比较小,以流感嗜血杆菌和不动杆菌为主。

随着新型有效的药物不断被推出,供眼科医师治疗眼表疾病时可选择的药物种类也相应增加,但由于多重耐药菌株在全球范围内普遍流行[10],这可能会降低抗生素治疗感染性眼病的有效性[11]。我们的药敏结果提示眼部凝固酶阴性葡萄球菌(表皮葡萄球菌和人葡萄球菌)对青霉素、苯唑西林、红霉素、克林霉素的耐药率均超过50.00%,对眼科常用药物环丙沙星、左氧氟沙星和复方新诺明的耐药率在20%左右。同时对不同部位所分离的凝固酶阴性葡萄球菌耐药率进行比较,非眼部葡萄球菌对喹诺酮类药物的耐药率远高于眼部且差异有统计学意义(P<0.05)。有关细菌耐药性的报道在不同地区差异性比较大,这可能与用药习惯和生活环境有关。例如,有研究[12-14]报道,葡萄球菌对左氧氟沙星、环丙沙星和莫西沙星的敏感率低,Laura 等[12]报道中指出,葡萄球菌对甲氧西林和红霉素的耐药率较高。本研究未发现眼部凝固酶阴性葡萄球菌对莫西沙星、利福平和万古霉素耐药,这提示眼科医师优先使用这些药物治疗凝固酶阴性葡萄球菌引起的眼部感染可能会有比较理想的治疗效果。目前,虽还未有眼部分离出耐万古霉素葡萄球菌的报道[15-18],但随着高级别抗生素在临床上的使用越来越多,不免使我们对万古霉素治疗效果产生担忧,这需引起临床医师的足够重视,按照药敏结果合理选择药物。

有文献[15]指出,MRCoNS菌株会明显增加葡萄球菌对其他抗生素的耐药性。在本研究中,我们发现MRCoNS组对抗生素的耐药率明显高于MSCoNS组,其中青霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、复方新诺明五种药物耐药性比较差异有统计学意义(均P<0.05)。MRS耐药机制多由mecA基因介导,其基因表达产物是低亲和力的青霉素结合蛋白2a,会降低与β-内酰胺类药物的亲和力(五代头孢菌素除外),由它引起的眼部感染除增加治疗难度外也可能会导致患者预后不良,同时此类细菌易在院内进行传播,也是院感重点监测的耐药菌[19]。我们研究中采用的PCR检测mecA基因和VITEK 2 Compact仪器法对MRCoNS苯唑西林耐药性预测的结果符合率是97.5%,其中1例mecA基因阳性菌株经仪器检测显示对苯唑西林敏感,这可能与苯唑西林是诱导mecA基因表达的一种弱诱导剂以及mecA第二启动子的错义突变和单一突变有关[20],当“隐形”MRCoNS接触到β-内酰胺类抗生素时,便可能转变为高度耐药菌株,所以将检测耐药表型和mecA基因或青霉素结合蛋白2a的方法联合起来对筛选或鉴定耐甲氧西林葡萄球菌尤为重要。

综上所述,G+球菌为眼表的主要定植菌,其中凝固酶阴性葡萄球菌为主要优势菌,我们应加强对葡萄球菌特别是MRS耐药性的监测,指导临床根据药敏结果合理规范使用抗生素。