人工膝关节不同体外磨损周期的UHMWPE磨屑特征及细胞毒性研究

付松卿 ,王 松 ,陈 凯 ,张 述 ,秦 颖 ,彭业萍 ,刘伟强,2

(1.清华大学 机械工程系,北京 100084;2.深圳清华大学研究院 生物医用材料及植入器械实验室,广东 深圳 518057;3.中国矿业大学 材料与物理学院,江苏 徐州 221116;4.天津医疗器械质量监督检验中心,天津 300384;5.天津科技大学 生物工程学院,天津 300457;6.深圳大学 机电与控制工程学院 广东省电磁控制与智能机器人重点实验室,广东 深圳 518060)

随着全球人口老龄化加剧，骨关节炎逐渐成为最主要的致残性疾病之一[1].人工关节置换术则是1种专门针对终末期骨关节炎的成熟治疗方法.膝关节作为骨关节炎最常见的发病部位之一，每年都有大量患者接受人工膝关节置换[2].用于置换术的人工关节材料需要满足轻量化和生物相容性好等要求.自Charnley型人工髋关节诞生以来，人工关节材料从不锈钢发展到钴合金、高分子聚合物和生物陶瓷等，而目前广泛应用的人工膝关节假体则由钴合金和超高分子量聚乙烯(UHMWPE)制成[3].UHMWPE凭借其优异的机械性能和生物相容性，在人工膝关节领域得到大量研究，并常制成胫骨衬垫与钴合金股骨髁配合[4].人工膝关节的长期可靠性对于患者极为重要，研究表明大部分的膝关节翻修是由人工关节无菌性松动引起的，而磨屑诱导的假体周围骨溶解是导致无菌性松动的首要原因[5].由于UHMWPE的耐磨性比钴合金更差，人工膝关节假体磨损产生的磨屑也主要源于UHMWPE[6].因此，当前人工膝关节磨屑的研究主要聚焦于UHMWPE磨屑的定量表征.

采用人工膝关节摩擦磨损试验机开展体外磨损试验已成为研究磨屑生成和特征分析的主要方法，但对不同磨损周期下UHMWPE磨屑的数量、尺寸、形状和分布等特征的定量研究仍较少.一方面是由于体外磨损试验一般采用小牛血清溶液作为润滑液，其中的血清蛋白等生物大分子会对磨屑提取产生严重干扰，需要通过使其中的生物大分子水解或变性降解的方式将其与磨屑分离，试验流程较为复杂[7].另一方面，磨屑数量众多，对其形态和尺寸等特征的定量提取较为繁琐.鉴于此，本研究中通过酸处理法分离生物润滑液中的人工膝关节UHMWPE磨屑，并结合自主开发的磨屑特征识别算法对磨屑的扫描电子显微镜(SEM)照片进行分析，揭示人工膝关节不同体外磨损周期下UHMWPE磨屑特征.

此外，考虑到UHMWPE磨屑会诱导成纤维细胞吞噬异物并引起其凋亡，这一生物作用机制也是导致骨溶解现象出现的重要原因之一[8].因此，本研究中系统开展不同尺寸和浓度的UHMWPE磨屑对小鼠成纤维细胞的细胞毒性的影响，以期为未来人工膝关节设计和使用提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 试验材料

人工膝关节体外模拟磨损试验选择CoCrMo合金为股骨髁和高交联超高分子量聚乙烯(UHMWPE)胫骨衬垫配副的人工关节来开展，CoCrMo股骨髁为铸造钴铬钼合金，购买自施乐辉医用产品国际贸易(上海)有限公司，UHMWPE胫骨衬垫由江苏德键医疗科技发展有限公司提供.CoCrMo股骨髁表面粗糙度不大于0.05 μm，UHMWPE胫骨衬垫表面糙度不大于0.3 μm.人工膝关节摩擦磨损试验机(Simulation Solution Ltd，UK)具有6个自由度和5个轴，能同时实现轴向力(A/F)、外展和内收(A/A)、上弯屈伸展摆动(F/E)、下试样扭转和下试样前后方向位移(A/P)的加载功能，试验加载参考 ISO 14243 标准中规定的膝关节运动标准曲线，磨损周期为500万次.润滑液为去离子水与新生牛血清(杭州四季青)按体积比为1:1的混合溶液，其蛋白质浓度约为20 g/L，添加适量庆大霉素-两性霉素混合溶液以防润滑液在试验过程中变质(1 L上述润滑液加入100 mg庆大霉素和25 mg两性霉素).试验过程中每隔50万次磨损周期取1次含有磨屑的润滑液，并注入新的润滑液.试验中分别选取磨损周期为100万次、200万次、300万次、400万次和500万次的润滑液这5组试样作为磨屑样本来源.

由于难以控制试验中分离所得到磨屑的尺寸和浓度，因此选择了尺寸分别为5、10和 25 μm和纳米级的UHMWPE颗粒代替UHMWPE磨屑，并利用完全培养基将其浓度分别配置为0.1、0.5和2.5 mg/mL，因此得到12组用于细胞毒性试验的试样.细胞毒性试验的试验对象为小鼠成纤维细胞L929.

1.2 试验方法

1.2.1 磨屑分离

试验中采用酸处理法将人工膝关节UHMWPE磨屑从润滑液中分离出来，具体步骤如图1所示.首先取2 mL含有人工膝关节磨屑的润滑液，超声振荡1 h使其分散均匀，将震荡后的润滑液加入8 mL体积分数为37%的浓盐酸中，并在60 ℃水浴条件下处理1 h.待处理后的溶液冷却至室温，再将其以10 000 r/min的转速离心处理2 h.由于UHMWPE密度较小且略低于水，离心后大部分的UHMWPE磨屑分布在离心管上层[9]，取1 mL上层悬浮液，并用50倍体积的甲醇稀释悬浮液[10].超声振荡1 h稀释后的悬浮液，使磨屑重新分散均匀，用孔径为0.05 μm的聚碳酸酯膜对液体进行真空抽滤，再将聚碳酸酯膜转移进通风橱干燥12 h，便可得到分离提纯的UHMWPE磨屑.在分离过程中，应当注意避免各步骤中溶液和仪器与外界发生接触，以免引入杂质影响后续观测效果.对前文中所述5组试样分别重复3次此操作后，得到15张附着UHMWPE磨屑的聚碳酸酯膜，并进行电镜形貌分析.

Fig.1 Separation steps of UHMWPE wear debris:(a) ultrasonic oscillation;(b) heating in water bath;(c) high-speed centrifugation;(d) dilution with methanol;(e) vacuum filtration;(f) drying图1 UHMWPE磨屑分离步骤：(a)超声振荡；(b)盐酸水浴；(c)高速离心；(d)甲醇稀释；(e)真空抽滤；(f)通风干燥

1.2.2 磨屑的SEM照片处理

本研究中用扫描电子显微镜(SEM)进行UHMWPE磨屑形貌观测.首先，用碳胶带将干燥后附有磨屑的聚碳酸酯膜粘贴在显微镜样品台上，再进行镀层厚度5 nm左右的喷金处理，使聚合物表面具备导电性.之后将其移入扫描电子显微镜样品室进行观察，加速电压为5 keV，放大50 000倍左右.为了保证观测结果的随机性，采用一定规律在每个样品的36个特定位置进行观察，并获得磨屑的SEM照片.

对于UHMWPE磨屑形貌观测后获得的SEM照片，需要对其中的所有磨屑进行目标检测和轮廓提取，从而获得其各项特征尺寸数据.由于磨屑照片和背景差异较为显著，利用机器学习的方法，可以获得快速且优异的处理效果.在本研究中使用YOLOv4[11]和U-Net[12]网络来处理UHMWPE磨屑照片，其中前者用于进一步确定单个磨屑在照片上的位置和区域，后者用于提取磨屑的轮廓，算法处理效果如图2所示.获得磨屑照片轮廓坐标数据后，结合照片比例尺等信息，可以计算得出磨屑的各项尺寸数据，如面积(A)、长径(dmax)、短径(dmin)、长宽比(r)、圆度(R)、矩形度(Re)和形状因子(F)等.

医学模拟教学（simulation based medical education，SBME）是通过模拟技术对患者、临床进行模拟操作，仿真的进行治疗，创造出高真模拟场景，进行临床教学和试验的教学方式[1]。该种教学方式的重复性较好，训练的内容比较真实，规范性高，成本较低，因此能够有较高的应用价值，能够让医学生对基本的操作规范进行掌握，具有很大的优势，可以弥补教学病种的缺失，诊疗病例不足等问题，提升学生的综合操作能力和处理能力[2-3]，现在临床教学中已经有比较多的应用。模拟人为主的教学模式得到了医学教育界的广泛认可[4]。此次主要是对模拟教学应用于全科医学专业研究生教学的效果进行探讨分析。

Fig.2 Effect of contour extraction:(a) SEM micrograph of wear debris;(b) contour of wear debris图2 轮廓提取效果：(a)磨屑电镜图像；(b)磨屑轮廓

1.2.3 磨屑细胞毒性

将培养好的小鼠成纤维细胞制备成浓度为5×105mL-1的细胞悬液，再将细胞悬液接种至96孔板.向64个孔中加入90 μL细胞悬液，其中48个作为试验组(Mimic)，16个作为对照组(Control)；向另外16个孔中加入90 μL完全培养基，作为空白组(Blank).向48个试验组孔内加入10 μL试样，12组试样每组重复4次，并向剩下32个孔内加入10 μL完全培养基.培养细胞24 h后，向各孔加入10 μL CCK-8(Cell counting Kit-8)试剂，继续培养2 h使培养液充分发生显色反应，如图3所示.使用荧光显微镜观测和记录细胞生长形态，并利用酶标仪测定培养液光密度(Optical density,OD)，将光密度数据平均值代入如下公式，即可计算出小鼠成纤维细胞增殖率(P).

Fig.3 Cytotoxicity analysis according to the color development of 96-well plate culture medium图3 根据96孔板培养液显色进行细胞毒性分析

2 结果与讨论

2.1 不同体外磨损周期的UHMWPE磨屑特征

针对5组润滑液样本，共收集到540张SEM照片，从中提取了1 217粒磨屑轮廓，基于后验知识和能谱分析，除去259个在形态、尺寸和元素构成上异常的颗粒数据，获得了958个有效磨屑轮廓数据.在958个有效磨屑中，来自100万、200万、300万、400万和500万磨损周期润滑液的分别是137个、189个、245个、261个和126个，可见随着磨损循环次数增加，磨屑生成数量呈现先增多后减少的趋势.

在磨屑尺寸数据方面，本研究中重点关注磨屑长径这一最为关键的特征，即磨屑轮廓上任意连线经过质心的两点间最大欧式距离，后文如未特别指定，尺寸均指磨屑长径.不同体外磨损周期的UHMWPE磨屑尺寸分布如图4所示，图中Mc为数量单位“百万次”.从图4中可以看出45.6%的磨屑长径小于1 μm，14.1%的磨屑长径为1～5 μm，11.0%的磨屑长径为5～10 μm，11.6%的磨屑长径为10～25 μm，17.7%的磨屑长径大于25 μm.此外，无论磨屑来自哪个磨损周期，都以长径小于1 μm的占比最多，且到磨损后期时(400万次和500万次)，纳米级磨屑占比急剧增加，甚至达到80%以上，而尺寸大于10 μm的磨屑大多来自磨损早期.因此，可以得出结论，磨损过程中纳米级磨屑占比始终在30%以上，且随着磨损周期增加，纳米级磨屑占比逐渐增加.

Fig.4 Size distribution of UHMWPE wear debris in different million cycles in vitro图4 不同体外磨损周期的UHMWPE磨屑尺寸分布

在磨屑形状方面，ASTM F1877-16标准中定性地给出了颗粒物的形状类别，但并未具体说明如何根据磨屑的特征参数来进行定量的分类，标准中磨屑的形状分类仍然较为主观.McMullin等[13]结合ASTM F1877标准和受试者判断，开发了基于统计的方法，将超高分子量聚乙烯磨屑的形状与尺寸数据定量地联系了起来.本研究中根据实际的观测情况和归纳推理，对磨屑的外形进行了分类，由整理得到的长宽比、圆度和矩形度等磨屑几何参数得出的分类逻辑，即圆度大于0.9的归为球状，其余磨屑中矩形度大于0.8的归为片状，其中长宽比大于2.5的归为杆状，矩形度小于0.4的归为纤维状，其余磨屑中圆度大于0.3且矩形度大于0.5的归为颗粒状，剩下不便分类的作为其他.

不同形状磨屑的典型SEM照片如图5所示.从图5中可以发现：球状磨屑表面非常光滑，且尺寸基本小于1 μm，形状较为规则；片状磨屑表面纹理光滑，厚度较小，边缘也较为平整，尺寸也以1 μm以下为主；纤维状磨屑表面纹理平整且光滑，边缘有卷曲现象，尺寸在1～5 μm；杆状磨屑体态较大，表面粗糙但边缘比较平整，尺寸多大于10 μm且可达数十微米；颗粒状磨屑厚度较大，边缘较平齐但表面粗糙，切削感严重，且尺寸分布较广，从纳米级到数十微米；其他磨屑表面较为粗糙，厚度适中，边缘存在一定的折叠和卷曲，部分呈现出撕裂感.

Fig.5 Different shapes of UHMWPE wear debris:(a) spherical;(b) flakes;(c) fibrillar;(d) rods;(e) granular;(f) others图5 不同形状的UHMWPE磨屑：(a)球状；(b)片状；(c)纤维状；(d)杆状；(e)颗粒状；(f)其他

根据试验结果绘制不同磨损周期下的人工膝关节UHMWPE磨屑形状数量分布如图6所示.不同周期产生的磨屑形状都以颗粒状占比最高.从整体上来看，颗粒状磨屑数量占比达62%，其次为占比12%的球状磨屑，片状、纤维状和杆状等类型磨屑则较少.对比不同周期下产生磨屑的形状，可以看出随着磨损周期数的增加，球状磨屑占比不断增加而纤维状磨屑占比不断减少；在100万次磨损周期下产生的杆状磨屑略多而片状磨屑较少，随着磨损周期增加，这2种形状的磨屑占比变化不大，且均较少.

Fig.6 Shape distribution of UHMWPE wear debris图6 UHMWPE磨屑形状分布

2.2 不同尺寸和浓度的UHMWPE磨屑细胞毒性

Fig.7 Average cell proliferation rate of mouse fibroblasts cultured with UHMWPE wear debris at different particle sizes and concentrations图7 不同尺寸和浓度下UHMWPE磨屑培养小鼠成纤维细胞的细胞增殖率

图8所示为荧光显微镜下观察到的不同尺寸和浓度的UHMWPE磨屑培养小鼠成纤维细胞的细胞形态照片.可以看出，图8(c)中死亡的细胞最多，视野中已出现大量细胞凋亡后的深色残余物，且几乎没有正常增殖的细胞，图8(b)中大部分细胞形态呈现为圆形，证明较多的细胞濒临死亡，图8(b)和图8(c)中对应的均是纳米级磨屑，且浓度分别是0.5和2.5 mg/mL.而同样采用纳米级磨屑的图8(a)中对应磨屑浓度为0.1 mg/mL，其细胞增殖状态更好，这同时也验证了前文中所述纳米级颗粒毒性最强且浓度越大细胞毒性越强的结果.图8(f)中展示了UHMWPE磨屑尺寸较小(5 μm)但浓度较大(2.5 mg/mL)时细胞的培养情况，其中的细胞相对图8(d)和图8(e)也出现了更多的圆形形态，这也证明了图7的结论，即对5 μm的磨屑而言，同样是磨屑浓度越大，细胞毒性越强.其他试样的细胞形态大部分呈现梭形，证明细胞增殖情况良好.

Fig.8 Fluorescent micrographs of cell morphology of mouse fibroblasts cultured with UHMWPE debris at different sizes and concentrations图8 不同尺寸和浓度下UHMWPE磨屑培养小鼠成纤维细胞的细胞形态的荧光显微镜照片

2.3 讨论

本研究中得到了不同体外磨损周期的UHMWPE磨屑，从磨屑形状上看，绝大部分为不规则的颗粒状，也有小部分球状和片状磨屑，以及极少数的杆状和纤维状磨屑.此外，不同体外磨损周期产生的磨屑在数量、尺寸和形状等特征上也存在显著差异：从数量上看，在400万次体外磨损周期之前，由于UHMWPE衬垫表面仍存在粗糙峰，由于疲劳和热效应，材料磨损情况会随着周期数增加而趋于严重，产生的磨屑数量也逐渐增多，而后材料表面的粗糙峰去除，变得更加光滑，产生的磨屑数量又开始减少；从尺寸上看，产生的大多数磨屑长径在5 μm以下，且随着磨损周期增加，磨损形式由磨粒磨损向疲劳和黏着磨损过渡，UHMWPE主要由切削去除变为黏着脱落，小尺寸磨屑的比例迅速增大；从形状上看，结合不同形状的典型SEM照片，可以推知颗粒状磨屑在磨损的各个时期都会大量产生，尺寸较大的纤维状和杆状磨屑则主要产生于磨粒磨损阶段，而球状磨屑主要产生于疲劳和黏着磨损阶段，因此随着周期数的增加，纤维状和杆状磨屑占比减少而球状磨屑占比增加.Chen等[14]的研究指出，人工膝关节UHMWPE假体的主要磨损机制是磨粒磨损和疲劳磨损.此外，还有大量体外研究[15-17]表明人工膝关节磨屑形状和尺寸分布范围与本文中得到的结果吻合.除了膝关节以外，人工髋关节也是最常被置换的关节.在Wu等[18]和Zohdi等[19]针对髋关节UHMWPE磨屑的研究中同样指出磨屑的尺寸为微纳米级，但髋关节磨屑整体尺寸略小于本文中提取得到的膝关节磨屑尺寸，后者的研究中也提出随着周期增加，髋关节UHMWPE磨屑的平均粒径减小.

在细胞毒性方面，UHMWPE磨屑尺寸和浓度均对小鼠成纤维细胞有显著影响，刘鹏等[20]指出磨屑可以通过影响成纤维细胞来引起骨代谢失衡.从尺寸上看，纳米级磨屑的细胞毒性最大，且比尺寸为5、10和25 μm的磨屑毒性要显著得多.Musib等[21]认为磨屑的细胞毒性与细胞自身尺寸有关：小鼠成纤维细胞本身尺寸为20～30 μm，能够容易吞噬1 μm以下磨屑，进而刺激凋亡进程表达，但更大的磨屑很难被吞噬且无直接的生理毒性.有学者认为，纳米级颗粒更具有生物毒性，其激活的炎症反应会带来更高的骨溶解发生率[22].浓度方面，在试验设计的浓度范围内，UHMWPE磨屑的细胞毒性随着磨屑浓度的增大而加剧，但与纳米级别尺寸的磨屑相比，微米级别尺寸的磨屑细胞毒性随浓度加剧的程度不如前者.

尽管本研究中为人工膝关节UHMWPE磨屑的分离和分析提供了可行的思路和解决方案，并且揭示了不同体外磨损周期的UHMWPE磨屑特征和尺寸以及浓度等对细胞毒性的影响规律，但未来仍有如下问题需要进一步开展：(1)增加磨屑样本量；(2)减少磨损循环取样周期；(3)构建不同磨损周期下的UHMWPE磨屑图谱.

3 结论

通过提取不同体外磨损周期下的人工膝关节UHMWPE磨屑，对其形状、尺寸和数量等特征进行分析，并针对UHMWPE磨屑探究对小鼠成纤维细胞的细胞毒性，得出以下结论：

a.人工膝关节体外磨损的UHMWPE磨屑形状特征为颗粒状磨屑占比可达62%，其次为占比12%的球状磨屑，片状、纤维状和杆状等类型磨屑则较少.

b.不同磨损周期下的UHMWPE磨屑尺寸特征为磨损过程中纳米级磨屑占比始终在30%以上，且随着磨损周期增加，纳米级磨屑占比逐渐增加，最高可以达到80%.

c.不同磨损周期下的UHMWPE磨屑数量特征为随着磨损周期增加，磨屑数量呈现先增多后减少趋势.

d.磨屑细胞毒性方面，纳米级磨屑细胞毒性最强，随着磨屑尺寸从5到25 μm增加，细胞毒性逐渐减小；在0.1～2.5 mg/mL浓度范围内，细胞毒性基本遵循磨屑浓度越大毒性越强的规律.