维生素E 稳定型高交联聚乙烯人工膝关节磨屑的分离提取

郑 晔, 黄秀玲, 冯 景, 朱俊俊, 华子恺

(上海大学机电工程与自动化学院, 上海 200444)

近年来, 随着老龄人口增多、骨关节疾病发病率逐年上升, 人工关节置换术需求也随之扩大. 人工膝关节置换术的10 a 存活率为90% 以上[1], 尽管如此, 仍有患者需要术后翻修. 随着人工关节置换术数量的不断增加, 失效的绝对数量仍然较大. 有文献报道, 70%的翻修手术是由无菌性松动引起的[2]. 磨损产生的磨屑在假体松动的发生发展过程中起着关键性作用[3].尤其是聚乙烯(polyethylene, PE) 磨屑, 数量多(70%∼90%), 分布广, 可以引起假体周围骨界面附近的生物学反应, 继发骨溶解并最终导致假体无菌性松动, 进而制约人工假体的使用寿命[4-8]. 因此, 研究人工关节假体材料及其磨屑尤为重要.

超高分子量聚乙烯(ultra high molecular weight polyethylene, UHMWPE) 磨屑已被大量研究, 并形成了标准分离提取方法——ISO 17853:2011. 随着人工关节材料的更新换代, 一种抗氧化、低磨损的维生素E 稳定型高交联聚乙烯(vitamin E stabilized highly cross-linked polyethylene, VE/HXLPE) 出现. VE/HXLPE 人工关节的磨损率明显低于UHMWPE[9], 但VE/HXLPE 磨屑同样存在无菌性松动和骨溶解风险. 此外, VE/HXLPE 磨屑是否可以用现有标准提取还未知, 且润滑介质降解后的取样量对磨屑表征影响尚无全面、系统的研究. 针对以上问题, 本工作将通过实验探究现有的磨屑提取方法是否适用于低磨损VE/HXLPE 膝关节磨屑, 并分析润滑介质降解后的消化液取样量对其磨屑数量、体积和形貌特征等的影响.

1 实验材料与方法

1.1 方案设计

基于ISO 17853:2011 标准, UHMWPE 磨屑的分离提取一般包括2 个步骤: 血清的消化和磨屑的收集. 消化血清的方法有盐酸消化法和NaOH 消化法, 其中酸消化法对血清蛋白清除效率较高、成本低、易操作, 是聚乙烯磨屑分离提取的首选方法.

采用酸消化法对润滑介质中的VE/HXLPE 膝关节磨屑进行提取, 标准方法的步骤如下:①将冷冻的固态小牛血清(内含磨屑) 从冰柜中取出, 刮掉表面沉积物后在常温下解冻10 h;②将血清均匀搅拌5 min 并量取10 mL, 使取样具有代表性; ③取40 mL 盐酸溶液(体积分数为37%) 与10 mL 血清混合, 50◦C 水浴恒温搅拌1 h, 得到浅紫色消化液; ④取0.5 mL 消化液加至100 mL 无水甲醇溶液中搅拌均匀, 通过0.05 µm 聚碳酸酯滤膜真空抽滤, 滤膜上的颗粒即为提取的磨屑.

图1 为不同取样量VE/HXLPE 磨屑的扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)图. 可以看出:取样量0.5 mL 时提取的VE/HXLPE 膝关节磨屑在低倍和高倍SEM 图中均难以达到表征数量(见图1(a)). VE/HXLPE 人工膝关节磨损量低, 直接导致磨屑数量减少. 分析标准方法中与磨屑数量有关的参数可知, 消化液取样量直接影响呈现在滤膜上的磨屑数量.

图1 VE/HXLPE 磨屑SEM 图像Fig.1 SEM images of VE/HXLPE debris

研究磨屑群体可以克服磨屑研究的随机性, 能够更客观、全面反映人工关节磨损过程的演变规律. 我们推测消化液取样量的变化会影响磨屑的数量, 从而最终影响磨屑的表征. 因此, 将标准方法步骤④中的取样量新增4 组(1.0、2.0、4.0 和6.0 mL), 探究取样量对低磨损VE/HXLPE 人工膝关节磨屑数量、体积、形貌特征等的影响. 由图1(b) 可知, 若仅改变取样量为1.0 mL, SEM 图像中的磨屑数量明显增加.

1.2 实验方法

1.2.1 磨屑的制备、分离与提取

采用Orthotek 实验室的人工膝关节磨损试验机(型号JointWear-K4301), 以小牛血清为润滑介质, 根据ISO 14243-3 进行总循环次数为500 万次的金属股骨髁和VE/HXLPE 胫骨衬垫配副的人工膝关节步态体外磨损试验, 每50 万次循环使用450 mL 小牛血清, 在每50 万次结束后暂停设备回收小牛血清润滑介质(内含磨屑) 并及时放入冰箱冷冻保存, 直至达到总循环次数. 表1 为试验参数. 选取第450 万次∼第500 万次循环(此阶段处于稳定磨损状态)产生的磨屑进行分析. 试验结束后, 采用标准方法以不同取样量提取磨屑进行研究.

表1 试验参数Table 1 Test parameters

1.2.2 磨屑的观测与表征

裁剪带有磨屑的滤膜, 并用碳胶粘贴在铝块上. 为使磨屑具有导电性, 需要对滤膜进行喷金处理. 使用日本JEOL 公司的JSM-7500F 冷场发射扫描电子显微镜对磨屑进行观测, 放大倍数为5 000∼10 000 倍, 加速电压为5 keV, 每个样品均在视野范围内随机获取20 张清晰图像.

利用图像分析软件Image-Pro Plus 将磨屑从图像中分离, 得到磨屑的数量、最大直径dmax、最小直径dmin、周长P、长度L、宽度W、面积A (见图2), 并计算等效圆直径DEC、纵横比RA、延伸率E、圆度R 和形状因子FF等参数, 对磨屑尺寸、形状进行描述.

图2 磨屑参数Fig.2 Wear debris parameters

根据图像区域内的平均磨屑数量nm, 计算不同取样量下滤膜上的磨屑总数nT:

式中: SL为每张滤膜的有效过滤面积; SP有每张图像面积.

根据图像区域内的平均磨屑体积Vm, 计算不同取样量下滤膜上的磨屑总体积VT. 原子力显微镜观测到磨屑厚度h 可通过线性回归法确定为约等于磨屑等效圆直径DEC的1/3[10], 据此估算获得的磨屑体积:

式中: nP为图像数.

等效圆直径DEC是与磨屑投影面积相等的圆的直径, 是衡量磨屑尺寸的一个重要参数:

纵横比RA是描述磨屑形状的常用参数:

式中: dmax是磨屑轮廓上任意两点之间所能画出的最长直线距离; dmin是垂直于大直径的最长直线距离.

延伸率E 与RA类似, 更适用于描述长形磨屑, 尤其是纤维状磨屑:

圆度R 用来衡量磨屑与圆的相似程度,

形状因子FF与R 类似, 对磨屑轮廓的粗糙度变化更为敏感:

将统计到的VE/HXLPE 磨屑进行分析, 得出磨屑参数的频率分布图及箱型图, 再使用IBM SPSS Statistics 26 软件分析统计数据的显著差异性. 描述数据统计描述的表示形式为m±s (平均值± 标准差), 数据若符合正态分布且方差齐次, 则采用单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA); 若不符合正态分布则采用曼-惠特尼-U 非参数检验. 检验水准设定α=0.05.

2 结果与分析

2.1 磨屑观测

图3 为不同取样量下提取的VE/HXLPE 人工膝关节磨屑的SEM 图像. 由图3 可以看出: 磨屑均呈白色不透明状; 放大5 000 倍时, 磨屑密度随着取样量的增加而增大, 并呈不规则的类球形、片状、棒状或丝状, 形状复杂且表面粗糙. 在0.5、1.0、2.0 mL 取样量下, 磨屑轮廓清晰且形状完整, 但在4.0、6.0 mL 取样量下, 磨屑出现团聚状态, 颗粒重叠、轮廓模糊, 干扰后续的计数与表征. 这可能是由于磨屑经抽滤方式沉降时, 过量磨屑重叠分布于滤膜. 图4 为团聚磨屑的SEM 图像. 可以看出: 4.0、6.0 mL 组的滤膜孔径模糊不清, 磨屑轮廓模糊且呈团聚态; 对于相互缠绕的纤维状磨屑, 其数量统计和形貌表征均受到严重影响.

图4 团聚磨屑的SEM 图像Fig.4 SEM image of agglomerated debris

SEM 图像模糊也可能是小牛血清中未消化的蛋白质所致. 蛋白质降解是磨屑提取的首要环节, 本实验采用酸消化法降解蛋白质. 强酸降解蛋白质操作简单、时间短、效率高, 但降解蛋白质的效率并非100%. 张涛[11]用50 mL 浓盐酸在60◦C 水浴中搅拌降解10 mL 的小牛血清溶液1 h, 结果显示溶液中蛋白质的消化率最高时为71.87%, 表明仍有部分蛋白质包覆于磨屑上. 图5 为未降解网状蛋白质包覆磨屑的SEM 图像. 可以看出, 磨屑边缘和滤膜的分界模糊, 导致SEM 图像上可统计的磨屑少. 因此, 本工作仅对取样量为0.5、1.0、2.0 mL 组别进行分析讨论.

2.2 磨屑鉴定

图6 为随机域中颗粒在滤波器上的X 射线能谱分析. 可以看出, 各组谱图均显示C 元素峰最明显, O 元素峰次之, 无明显的Co、Cr、Ti、Mo 元素峰. 表2 给出了随机域中颗粒不同元素的质量分数. 由表2 可知, C、O 元素的质量分数合计高达99%, Co、Cr、Ti、Mo 元素的质量分数合计不足1%. 本实验中关节配副材料为金属与聚乙烯, 能谱显示磨屑主要由非金属元素组成, 由此可判断分离提取的颗粒为聚乙烯磨屑(含C、H 元素). 质量分数最高的C 元素来自磨屑和滤膜(含C、H、O 元素), 而质量分数较高的O 元素可能来自滤膜.

表2 随机域中颗粒不同元素的质量分数Table 2_The mass fraction of different elements of the particle in the random domain%

图6 随机域中颗粒在滤波器上的能谱分析Fig.6 Energy spectrum analysis of particles on filters in the random domain

2.3 提取方法对磨屑数量的影响

VE/HXLPE 膝关节磨屑以不同取样量分离提取后, 对其SEM 图像进行磨屑计数统计,得到单位图像区域内磨屑数量的平均值与标准差(见表3).

表3 每张图像内VE/HXLPE 磨屑数量Table 3 The quantity of VE/HXLPE debris in each image

扫描电镜放大5 000 倍时, SP约为420.85 µm2(23.37 µm×17.78 µm), SL约为6 361.73 mm2(45 mm×45 mm×π). 将上述数据代入式(1), 计算不同取样量下提取到的磨屑总数, 并做组间差异性分析以确定磨屑数量分布是否存在显著性差异, 结果如图7 所示.

图7 过滤面积内的VE/HXLPE 磨屑数量Fig.7 The quantity of VE/HXLPE debris in the filtration area

由图7 可知, 磨屑数量随取样量的增加而增加, 但非严格按照取样量的倍增而倍增. 取样量0.5 mL 代表现有标准下VE/HXLPE 磨屑的提取数量, 与取样量1.0、2.0 mL 组之间均存在显著性差异(P < 0.05). 以图像中磨屑数量估计体外测试中小牛血清所含的全部磨屑数量,结果如图8 所示. 对比标准取样量0.5 mL 下的VE/HXLPE 磨屑提取数量, 取样量1.0 mL组的提取效率为115%, 2.0 mL 组的提取效率为117.5%.

图8 体外测试小牛血清中的VE/HXLPE 磨屑总数Fig.8 Total numbers of VE/HXLPE debris in calf serum was tested by vitro test

2.4 提取方法对磨屑体积的影响

VE/HXLPE 膝关节磨屑以不同取样量分离提取后, 对各取样量下的磨屑体积进行计算,得到每张图像区域内统计到的平均磨屑体积结果(见表4).

表4 图像内VE/HXLPE 磨屑平均体积Table 4 Average volume of VE/HXLPE debris in images

通过表4 中的数据计算小牛血清中的磨屑总体积,并与体外测试的人工膝关节磨损量对比.实验中VE/HXLPE 人工膝关节磨损量为(11.68±3.16)mg/Mc,材料密度为0.940 mg/mm3,可得磨损体积为(12.43±3.36) mm3/Mc. 根据式(2), 可计算每百万次循环后提取磨屑的总体积, 结果如图9 所示. 通过计算可知, 当取样量为0.5、1.0、2.0 mL 时, VE/HXLPE 磨屑的提取效率分别为66%、82%、93%.

图9 不同取样量下VE/HXLPE 磨屑的总体积Fig.9 Total volumes of VE/HXLPE debris

2.5 提取方法对磨屑形貌的影响

2.5.1 磨屑尺寸

图10 为本实验提取磨屑的等效圆直径DEC分布情况. 可以看出, VE/HXLPE 磨屑的尺寸分布范围广泛, DEC为0.1∼10.0 µm, 其中90% 以上为0.1∼1.0 µm, 小于1.0 µm 或大于10.0 µm 的磨屑较少, 这与文献[12] 中给出的磨屑尺寸范围一致. 由于小尺寸磨屑数量多, 大尺寸磨屑数量少, 磨屑尺寸与磨屑数量之间呈右偏峰态分布. 另外, 各取样量下的磨屑大多为0.1∼0.5 µm.

图10 VE/HXLPE 磨屑的DEC 分布Fig.10 DEC distribution of VE/HXLPE debris

磨屑尺寸是决定细胞活性的关键因素, 分布大多为微米级(>1.0 µm)、亚微米级(0.1∼1.0µm) 和纳米级(<100 nm). 0.1∼10 µm 的磨屑可刺激巨噬细胞吞噬, 引起炎症/细胞因子的产生, 从而导致骨溶解, 其中亚微米级磨屑(0.1∼1.0 µm) 的生物活性更高[13-15]. 临床上已发现较小的磨屑更易从植入部位移动扩散, 且临界尺寸为0.2∼0.8 µm 的磨屑更是引起生物反应的关键[16]. 表5 为不同取样量下VE/HXLPE 磨屑尺寸. 通过以上分析可知, 磨屑尺寸均在活性范围内, 故取样量对尺寸所决定的磨屑生物活性无明显影响.

表5 VE/HXLPE 磨屑尺寸Table 5 VE/HXLPE debris sizes

2.5.2 磨屑形状

磨屑的形状对细胞活性的影响不可忽视. 较多研究表明, 细长形磨屑比球形磨屑生物活性更活跃, 可刺激细胞分泌更高水平的炎症因子[17]. RA与E 均为表征磨屑形状是否为细长形的参数, 值从1 开始, 值越大代表磨屑形状越偏细长, 生物活性也越高. 图11 为各取样量下磨屑形状参数RA、E、R、FF的箱型图. 表6 为磨屑各形状参数的平均值. 由图11 和表6 可知,0.5 mL 下VE/HXLPE 磨屑的RA和E 平均值最大, 2.0 mL 组磨屑的RA和E 平均值较大.根据RA将磨屑分为类球状和纤维状, 若RA>2, 则磨屑为纤维条状(包含条状、棒状及部分片块状颗粒); 若RA≤2, 则磨屑为类球状[18]. 根据上述分类, 本工作中, 0.5 mL 组纤维条状磨屑占比10.71%, 而2.0 mL 组纤维条状磨屑占比11.60%.

表6 VE/HXLPE 磨屑形状参数的平均值Table 6 Average values of shape parameters of VE/HXLPE debris

图11 VE/HXLPE 磨屑形状参数Fig.11 Shape parameters of VE/HXLPE debris

R 与FF是衡量磨屑形状与圆的相似程度, 值为0∼1. R 与FF的值越接近1 表示磨屑形状越偏向圆形, 其生物活性也越低; 而值越接近0, 磨屑的生物活性越高. 由图11 和表6可知, VE/HXLPE 磨屑在取样量2.0 mL 的R 和FF平均值分布与0.5 mL 组无显著性差异(P >0.05), 而与1.0 mL 组存在显著性差异(P <0.05).

3 结 论

本工作通过实验探究了现行磨屑提取方法是否适用于低磨损VE/HXLPE 膝关节磨屑,同时分析了消化液取样量对提取磨屑各表征参数的重要影响. 结果表明: 改变磨屑提取方法中的取样量会影响提取的磨屑数量、体积及形貌分布. 采用现行标准可提取到的VE/HXLPE 磨屑数量较少, 难以达到表征数量, 增大消化液取样量能够提取到更多的低磨损VE/HXLPE 膝关节磨屑, 更全面地表征磨屑群体, 为VE/HXLPE 人工膝关节产品应用提供更全面有价值的参考.