紫杉醇(二线)治疗晚期胃癌对外周血CD4+T、CD8+T细胞的影响及相关分析※

赵玲琳,韩静绮,骆玉霜*

(1.青海大学高原医学研究中心,西宁 810001;2.青海省人民医院,西宁 810007;3.青海大学附属医院,西宁 810001)

以紫杉醇为基础的化疗多作为晚期胃癌的二线化疗方案,紫杉醇输注前需要做激素预处理,其是否会抑制免疫功能影响疗效目前在学界存在争议。本研究观测紫杉醇(二线)治疗晚期胃癌对外周血CD4+T、CD8+T细胞的影响并行相关分析,以明确紫杉醇化疗对机体免疫功能的影响及晚期胃癌患者外周血CD4+T、CD8+T细胞数量与紫杉醇疗效及患者生存期的相关性。

1 资料与方法

1.1 资料

选取2019年10月至2021年12月在青海大学附属医院经病理学确诊的一线治疗失败晚期胃癌患者40例。纳入标准:①一线化疗未使用过紫杉类药物,二线化疗采用统一的紫杉醇方案,且至少完成2个化疗周期;②年龄18～75岁;③KPS评分≥70分,ECOG体能状态评分≤2分,预计生存期≥3个月;④有可经影像学(CT或MRI)评价的客观可测量病灶;⑤ 病例资料记录完整,患者知晓研究方案,并签署书面知情同意书。

本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求,并通过青海大学附属医院医学伦理委员会审核(SL-20190014)。

入选患者一般基线特征见表1。

1.2 方法

1.2.1 治疗方案设计

第1、8天给予紫杉醇(135 mg/m2,用500 mL生理盐水稀释后以静脉滴注方式使用,滴注时间为3 h,静脉滴注12、6 h前口服地塞米松(7.5 mg)预防过敏反应。21天为1个治疗周期,完成2个周期以上化疗。

1.2.2 疗效评价

疗效评价采用《实体瘤的疗效评价标准(RECIST1.1)》[1],每2个化疗周期后进行疗效评价。评价按完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)四种情况判断。化疗有效率(RR)=(CR+PR)/总例数×100%,疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)/总例数×100%。本研究将RR和DCR作为疗效评价指标。

1.2.3 外周血CD4+T、CD8+T细胞数量检测

抽取胃癌患者化疗前1日和2周期化疗结束时空腹外周静脉血2 mL入EDTA-K2抗凝管,充分混匀后每份血样取50 μL加入BD绝对计数管中,每管分别加入BD Multitest CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP、CD4-APC单克隆抗体(340503,BD Biosciences)各20 μL,振荡混匀,避光放置(20℃,15～20 min)。加入稀释(1:10)后的红细胞裂解液(R1010,Solarbio)约450 μL,振荡混匀,避光孵育(10～15 min)。离心(1500 r/min,5 min)弃上清后每管加入1～2 mL磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution,PBS),充分混匀(上述步骤重复操作1次)后加入500 μL PBS重悬待测细胞,充分混匀置暗处,2 h内用流式细胞仪检测(FACS Calibur,BD)。外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞数以流式细胞仪检测并用Multi SET软件分析。

1.2.4 统计学分析

用SPSS25.0统计软件行数据分析,用GraphPad Prism 8.0软件作图。计量资料行正态性检验,偏态资料以中位数及四分位数表示[M(P25,P75)],患者治疗前后外周血T细胞比较采用配对Wilcoxon符号秩和检验,多个独立样本采用Kruskal-Wallis检验,采用Kaplan-Meier及Log-rank检验法进行生存分析并绘制生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫杉醇(二线)治疗晚期胃癌对外周血CD4+T、CD8+T细胞的影响

比较40例胃癌患者做紫杉醇化疗前和2周期化疗结束时外周血CD4+T、CD8+T细胞数量和CD4+T/CD8+T变化。治疗前后差值行正态性检验显示其为非正态数据,行配对秩和检验显示紫杉醇化疗后外周血CD4+T、CD8+T细胞数量略高于化疗前,而化疗后CD4+T/CD8+T略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 化疗前后外周血CD4+T、CD8+T细胞数量[ M(P25,P75)]及比值

2.2 相关分析

2.2.1 分析化疗前外周血CD4+T、CD8+T细胞数量及比值与疗效的关系

40例患者疗效评价:CR 0例,PR 7例,SD 14例,PD 19例,RR为17.5%,DCR为52.5%。行Kruskal-Wallis检验显示,治疗疗效为PR组的患者其化疗前外周血CD4+T、CD8+T细胞数量高于SD、PD组的患者(P<0.05),而CD4+T/CD8+T与化疗疗效无关(P>0.05)。见表3。

表3 化疗前外周血CD4+T、CD8+T细胞数量及比值与治疗疗效的关系[M(P25,P75)]

2.2.2 分析化疗前外周血CD4+T、CD8+T细胞数量及比值不同水平患者的PFS、OS曲线

末次随访时间截至2022年3月31日,死亡33例(82.5%),存活7例(17.5%),存活患者生存期按随访截尾日期计算并按删失数据处理。紫杉醇(二线)化疗后中位PFS为5.0个月(95%CI:4.67～5.33),中位OS为9.6个月(95%CI:9.13～10.07)。分别以化疗前外周血CD4+T、CD8+T细胞数量中位数(545.5个/μL、442.0个/μL)及CD4+T/CD8+T中位数(1.16)为截点分为高值组、低值组。

分析化疗前外周血CD4+T、CD8+T细胞数量及CD4+T/CD8+T不同水平患者的PFS曲线:外周血CD4+T、CD8+T细胞数量高的患者其中位PFS虽高于低水平患者(5.2个月与4.8个月比较,5.2个月与4.9个月比较),但差异无统计学意义(P>0.05,图1A、B);而外周血CD4+T/CD8+T较高患者的中位PFS明显高于低水平患者(5.5个月与4.7个月比较),差异有统计学意义(P<0.05,图1C),提示化疗前外周血CD4+T/CD8+T越高患者PFS越长。

A:CD4+T细胞数量不同水平患者的PFS曲线;B:CD8+T细胞数量不同水平患者的PFS曲线;C:CD4+T/CD8+T不同水平患者的PFS曲线

分析化疗前外周血CD4+T、CD8+T细胞数量及CD4+T/CD8+T不同水平患者的OS曲线:外周血CD4+T细胞数量及CD4+T/CD8+T较高患者的中位OS虽高于低水平患者(9.9个月与9.6个月比较,10.6个月与8.8个月比较),但差异无统计学意义(P>0.05,图2A、C);而外周血CD8+T细胞数量水平不影响患者中位OS(9.6个月与9.6个月比较,P>0.05,图2B)。

A:CD4+T细胞数量不同水平患者的OS曲线;B:CD8+T细胞数量不同水平患者的OS曲线;C:CD4+T/CD8+T不同水平患者的OS曲线

3 讨论

恶性肿瘤的发生、发展及预后与机体免疫功能密切相关,在以细胞免疫为主的抗肿瘤免疫中,T淋巴细胞通过功能各异的亚群在抗肿瘤作用中发挥免疫调控作用。CD3+分子是成熟T淋巴细胞表面的共有标志,T淋巴细胞亚群主要包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg细胞)等[2]。CD4+分子表达在辅助性T细胞(Th)和诱导性T细胞(Ti)表面,通过直接和间接的方式参与介导其他的免疫细胞发挥活性,幼稚 CD4+T 细胞被抗原提呈细胞(APC)刺激后激活并分化为辅助T 细胞,通过分泌多种细胞因子调控体液、细胞免疫反应发挥抗肿瘤作用[3]。CD8+分子多表达在具有调节效应的抑制性T细胞(Ts)和具有杀伤作用的细胞毒T细胞(Tc)表面,幼稚CD8+T 细胞通过与APC结合,刺激活化为具有细胞毒性功能的杀伤细胞,并伴随分泌丝氨酸酯醇、穿孔素等杀伤肿瘤细胞[4],CD8+T细胞还可以通过释放肿瘤坏死因子及干扰素等细胞因子间接杀死靶细胞[5]。CD4+T/CD8+T的变化代表着T淋巴细胞亚群水平的变化,是反映机体免疫功能紊乱的敏感指标。据报道,CD4+T、CD8+T细胞与胃癌预后相关,已被推荐用于预后预测和疗效评估[6]。

紫杉醇是从紫衫树皮中提取分离的新型抗微管药物,通过与游离微管蛋白结合,组装成稳定的微管,抑制微管解聚,抑制肿瘤细胞有丝分裂,单独或联合其他药物治疗晚期胃癌显示出显著的抗肿瘤活性[7]。临床上,以紫杉醇为基础的化疗多作为晚期胃癌的二线及以上方案。紫杉醇单药方案通常为每3周给药1次,每次剂量为(200～225)mg/m2,ORR为17%～28%,中位生存时间为8个月左右[8]。Koizumi等人[9]在以氟尿嘧啶为基础的化疗期间,给病情进展的胃癌患者以紫杉醇(二线)治疗,有效率为17.5%,疾病控制率为70.0%,中位PFS为111天。本研究中观察到40例患者经紫杉醇(二线)治疗的有效率为17.5%,疾病控制率为 52.5%。研究表明[10],紫杉醇在直接杀伤肿瘤细胞的同时,还能对包括效应性T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、调节性T细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞发挥调节作用。有研究发现[11],与顺铂单药治疗相比,顺铂+紫杉醇对细胞毒性T淋巴细胞的上调作用更强,并降低调节性T细胞的数量,从而增加抗肿瘤细胞因子(IL-1和IFN-γ)释放,增强抗肿瘤作用。目前,免疫联合化疗被证实可提高胃癌治疗疗效。但紫杉醇以无水乙醇或者蓖麻油作为溶剂,为防止过敏反应,输注之前需要激素预处理,考虑到糖皮质激素对T细胞功能的潜在抑制作用,是否会抑制机体免疫功能影响抗肿瘤治疗疗效尚无定论。

对Keynote-407的研究[12]发现,在转移性鳞状非小细胞肺癌患者中,无论是需要激素预处理的紫杉醇还是无需激素预处理的白蛋白结合型紫杉醇,与帕博利珠单抗联用时患者客观缓解率无显著差别。对Keynote-355的研究[13]也发现,紫杉醇用药前的激素预处理并没有影响帕博利珠单抗的免疫治疗效果。从本研究可以看到,经紫杉醇化疗后外周血CD4+T、CD8+T细胞数量略高于化疗前,虽无统计学意义,但说明化疗前激素应用并没有抑制外周血CD4+T、CD8+T细胞,提示紫杉醇可能为免疫联合化疗治疗胃癌的优选药物。本研究看到化疗前外周血CD4+T、CD8+T细胞数量越高其化疗效果越好,化疗前外周血CD4+T/CD8+T越高的患者其PFS越长。因此,通过检测外周血T细胞数量和比值,可以初步了解胃癌患者机体免疫状态、评估患者对化疗的反应和对PFS的影响。但是本研究具有单臂设计、入组样本量小的局限性,同时由于临床样本异质性较大,下一步需要在更大范围的临床研究中进一步去探索验证,以确定研究结果的可靠性,并动态检测外周血CD4+T、CD8+T细胞数,延长总生存期的随访时间,为晚期胃癌化疗药物选择提供一定的依据。