冷等离子体处理技术在黄芪育种上的应用研究

唐 欣，姚 远，张丽丽，邵长勇，，尤 泳，郝林杰，惠云婷，王德成

（1．山东农业工程学院，山东 济南 250100；2．山东省种子有限公司，山东 济南 250100；3 中国农业大学，北京 100083）

1 引言

中药黄芪 (Leguminosae)又称戴糁、芰草、百木、黄耆,为豆科黄芪属的多年生草本植物[1]。世界范围内,黄芪大约有2000多个品种,主要分布于北温带,中国约有240多种,主要分布在荒漠地区,主产地为山西、黑龙江、内蒙古等。黄芪具有利水退肿、补气升阳、益气固表、托疮生肌、托毒排脓、抗衰老等功能[2]。蒙古黄芪含黄芪多糖及多种氨基酸,膜荚黄芪含黄酮、皂贰类成分,临床上黄芪有多方面的应用,并且在国内外得到广泛应用和发展,随着对黄芪药理作用研究的不断深入及其药用范围的不断拓宽,对其需求量也越来越大[3]。近年来，各地黄芪的人工栽培生产发展较快，并在栽培技术上取得了一些经验，但是,目前在当地黄芪生产中良种较为单一，已不能适应黄芪产业持续发展的需要，对建立黄芪GAD基地形成了制约，品种问题已成为黄芪产业持续发展的瓶颈[4]。生产实践表明，选育新品种已成为提升黄芪优质高效生产的有效途径之一,由于进行黄芪常规人工杂交育种存在着许多实际困难，黄芪自交亲和指数低，加之黄芪又是多年生作物，完成一个正常的生命周期约需3年时间，黄芪育种发展缓慢[5]。

冷等离子体技术作为一种种子处理新技术，国内外进行大量研究[6-7]。前人对小麦[8]、水稻[9]、番茄[10]、大豆[11]、大葱[12]等作物和蔬菜进行播前处理，改良生物学性状或是发芽指标。将该技术应用于农业育种在国内外尚属新的研究领域[13]，对于冷等离子体种子播前处理技术在农作物育种上的应用，山东省种子有限公司和中国农业大学等有关单位已经开始了尝试[14]，通过使用一定功率的冷等离子体对种子或其他生物体进行处理，不仅可以诱发植物当代性状变化，并且在二代乃至三代依然保持形状改变，并且具有一致性规律[15]。通过反复试验，运用冷等离子体种子处理技术，结合分子标记技术和同工酶鉴定技术进行辅助育种，以及利用杂交优势手段，已经利用该技术培育出了目标性状的农作物新品种。该技术突破了传统育种低水平重复、同质化严重和转基因育种潜在危险，以及太空育种经济投入巨大的缺点，可以缩短育种周期，在育种方法和手段上具有先进性[16]。冷等离子体处理功率人为可控，通过反复试验可以找到某种作物种子某一特定性状的处理功率，能更好地满足选育作物优良品种的需求[17]。

将种子经过冷等离子体处理，等离子可以穿透种子表皮，作用于复杂的生物大分子，吸收的部分能量迫使电子产生振动而转化为热能，等离子激发了生物大分子活性，被激活的潜在基因通过一个生长季的充分表达，产生一定的记忆性，刻在种子里，在下代种植之后，仍然积极表达，具有活力延续性[18]。本研究将冷等离子体处理技术运用到黄芪育种上，试图解决黄芪常规人工杂交育种存在着的许多实际困难，提升黄芪优质高效生产,突破传统黄芪育种低水平重复、同质化严重和转基因育种潜在危险，以及太空育种经济投入巨大的缺点。目前尚未见冷等离子体在黄芪育种方面的研究和报道。

2 材料与方法

2.1 材料

黄芪是世界上最重要的中草药之一，因此选择黄芪种子进行本研究。黄芪种子是通过正规渠道购买的“陇芪3号”。只选择没有明显缺陷的健康种子。

2.2 种子加工装置及原理

种子处理设备是中国农业大学和山东省种子有限公司等单位研制的2SZ-10型冷等离子体种子处理仪。该装置在模拟真空状态下进行密闭操作，是通过气体放电使气体电离而产生的，气体放电中，气体分子和原子吸取了外界的能量被分解和电离，成为带负电的电子和带正电的离子，形成等离子体。当种子通过等离子体辉光放电区时受到光的作用，光与种子表层相互作用时，光被吸收和散射，吸收的部分能量迫使电子产生振动而转化为热能，当物质分子吸收了光子，其电子会从较低能态（基态）跃迁到较高能态（激发态），引起物质的能态跃迁，从而使种子增强生命活力[19]。

2.3 处理方法

用冷等离子体种子处理技术对黄芪种子进行处 理，8 个处理分别为 0（CK），50W、100W、150W、200W、250W、300W 和 350W，对应处理时间为17S，每个处理150g，黄芪品种为陇芪3号。

2.4 试验设计

2.4.1 室内试验

8个处理按照牧草种子发芽试验操作规程，于2015年1月山东省种子有限责任公司质检室内进行。将纯净水置于培养皿中，至滤纸饱和，每个培养皿播入100粒无病、饱满大小均匀的黄芪种子，每个处理设三次重复。分别在25℃恒温光照培养箱内培养12天[20]，每天观察种子萌发情况，记录发芽数、保持各处理萌发环境相对稳定。根据所得数据计算发芽势和发芽率；发芽试验结束后，测量苗高和根长。

2.4.2 田间试验

8个处理的黄芪种子按照株行距20*15cm条播，在同一地块相同田间管理模式下种植比较。调查播种后一个月幼苗株高和分枝数；霜降调查一年生根的主根长、根粗、鲜根重；回收种子测定单株结实数，田间种植测定二代种子一年生根的主根长、根粗、鲜根重。该试验在山东省种子有限公司齐河试验站进行。

2.5 发芽率、发芽势和发芽指数

发芽率、发芽势及发芽指数的计算公式如下:

n1为第6天发芽数，n2为第12天发芽数，N为种子总数。利用方差分析软件对试验数据进行单因素随机区组试验方差分析。

2.6 苗高和根长的测量方法

在最后计数时，从每次重复中选出10株生长均匀的幼苗。用游标卡尺测定苗高和根长。

2.7 幼苗和主根长的测量方法

幼苗长势在出苗后一个月进行，从中间行选择10株连续单株，用尺子测定株高，测定叶片数；

霜降后用专用工具挖出完整的黄芪根，随机选取10个根测量根长[21]、根粗和鲜重。

根长：把根拉直直接测定长度

根粗：随机选10个黄芪根用小刀修齐顶端，游标卡尺测定粗度，取平均值。

株高：是指地面到苗顶最高点的测量值；

鲜重：随机选10个单株，从土壤中挖出、洗净后，用吸水纸或滤纸吸干根表面水分，用电子天平称取根鲜重。

2.8 结果与分析

采用SPSS软件对试验数据进行单因素随机区组试验方差分析。

3 试验结果及分析

冷等离子体处理条件下对黄芪种子的发芽势和发芽率的影响如图1所示：

图1 不同冷等离子体处理条件下黄芪种子发芽势和发芽率Figure 1 Germination vigor and germination rate of Astragalus seeds under different cold plasma

图1和表1可以看出，不同功率的冷等离子体处理对黄芪种子的发芽势均有不同程度影响。与对照相比，处理功率200W，发芽势比对照提高27.61% ，产生差异达到显著水平；处理功率100W测定的发芽势低于对照，对黄芪发芽起到了抑制作用，但差异不显著。而当处理功率50W、150W时，发芽势高于对照相关测定值，有差异但不显著；处理功率250W、300W和350W发芽势测定值与对照无差异。

表1 与对照相比不同冷等离子体处理条件下黄芪的发芽势和发芽率提高的比例Table 1 Compared with the control,the ratio of the germination vigor and germination rate of Astragalus membranaceus under different cold plasma treatment conditions

当处理功率为200W时，经过冷等离子体处理的黄芪的种子的发芽率提高最大16.01% ，显著高于对照；50W、250W和300W比对照提高，但不显著，150W和350W测定的发芽率与对照无差异；而处理功率100W发芽率的测定值显著低于对照。合适功率冷等离子体处理可以提高发芽指标，处理功率与发芽势、发芽率非正相关，随着功率增加呈马鞍型波动。

不同处理功率和处理时间对30日苗龄黄芪幼苗株高和分枝数有显著影响（图2、图3），在不同处理时间下，随着功率的增加，黄芪的株高和分枝数变化不同。处理功率200W时，30日苗龄测定的T1株高提高23.08% ，分枝提高27.66% ，此时株高和分枝数均到达峰值；此功率T2株高提高22.89% ，分枝提高24.19% 。处理功率200W的冷等离子体处理黄芪种子，可以促进其苗期长势。处理功率300W时，T1株高增加，分枝数减少；而处理功率350W时，T1分枝数增加，株高减少。可根据育种材料的育种方向，运用不同处理功率改良分枝数或植株高度。冷等离子体处理后黄芪T1和T2的株高变化幅度不同，但趋势基本一致。说明冷等离子体处理黄芪种子，对苗期分枝和株高的影响具有遗传性。

图2 不同冷等离子体处理条件下30日苗龄黄芪T 1和T2幼苗情况Figure 2 Condition of 30-day-old Astragalus T1 and T2 seedlings under different cold plasma treatments

图3 不同冷等离子体处理条件下30日苗龄黄芪T1和T2幼苗与对照相比增幅情况Figure 3 The increase of 30-day-old Astragalus T1 and T2 seedlings compared with the control under different cold plasma treatment conditions

冷等离子体处理对黄芪根系的影响如表2所示：

表2 不同冷等离子体处理条件下黄芪T1和T2一年生主根的情况Table 2 Annual taproots of Astragalus T1 and T2 under different cold plasma treatment conditions

由表2看出，不同功率的冷等离子体处理对黄芪种子的主根长和主根粗均有不同程度影响。处理功率200W，处理时间17S时，黄芪T1一年生主根长达到最大值，与对照产生显著差异；处理功率100W，处理时间18S时，主根长与对照无差异；处理功率50W、处理时间20S，处理功率150W、处理时间17S，处理功率250W、处理时间16S，处理功率350W，处理时间15S时，T1一年生主根长均高于对照，产生差异，但差异不显著；处理功率300W、处理时间15S时，T1一年生主根长低于对照，产生不显著差异；处理功率150-250W和350W时，T2一年生主根长均高于对照，产生不显著差异；处理功率100W和300W时，T2一年生主根长小于对照，差异不显著；由数据和方差分析可以得出，冷等离子体处理具有遗传性，遗传性 T1＞T2。

当处理功率100-200W时，黄芪T1一年生根粗均高于对照，产生显著差异；处理功率50W、250W和300W时，根粗亦高于对照产生差异，但差异不显著；当处理功率200W和350W时，黄芪T2一年生根粗比对照仍显著提高，具有遗传性。

由表3看出，处理功率0-250W或350W时，冷等离子体处理T1和T2根鲜重均不同程度增加；但处理功率300W时，T1和T2的测定的黄芪一年生根系鲜重均比对照降低。说明处理功率与根系改良情况并非正相关，亦并非全都是促进作用。不同作物不同处理功率差距大，需根据试验测定结果选择最优处理功率。

表3 不同冷等离子体处理条件下黄芪T1和T2一年生根重的情况Table 3 Annual root weight of Astragalus T1 and T2 under different cold plasma treatment conditions

当处理功率为200W时，经过冷等离子体处理的黄芪在T1和T2，其主根长、主根粗、根鲜重均优于对照，可作为遗传育种中改良根系的最佳处理方案。根系改良，对吸收深层土壤中的水分和养分更有突出作用，因为植物在生长过程中需要吸收大量的肥料和水分来供给枝叶生长和结果，植物的根系越发达，植株长势越强。说明冷等离子体处理促进了黄芪亲本根系发育和幼苗的生长。

4 讨论

冷等离子体技术作为一种种子处理新技术，将该技术应用于农业育种在国内外尚属新的研究领域[22]。运用冷等离子体处理黄芪育种材料，根据育种目标选出得到改良的优良材料。通过混合选择，采用杂交、自交和回交等常规育种手段，并结合分子标记和同工酶鉴定手段进行辅助育种[23]，选育得到了黄芪稳定材料，育种材料具有发芽指标提高、幼苗长势增强、根系改良等至少一种性状。通过抗性鉴定试验及品比试验，最终得到根系改良的优良黄芪新品种，符合预期标准[23-32]。

4.1 创造黄芪育种新思路、创新了黄芪育种新方法。该方法突破了传统黄芪育种低水平重复、同质化严重和转基因育种潜在危险，以及太空育种经济投入巨大的缺点，可以缩短黄芪育种周期，在黄芪育种方法和手段上具有先进性。

4.2 运用适量功率的冷等离子体种子处理，改良了黄芪性状某些性状，提高了变异率。具体表现在改良根系和提高结实。

4.3 冷等离子体处理的处理功率人为可控，有益变异率高，结合分子标记和同工酶鉴定利用，可以找到控制黄芪自交不亲和的基因，通过反复试验得出改良自交不亲和系的最佳的处理功率，能更好地满足选育黄芪品种的需求，选育出更为优良的黄芪新品种。

5 结论

5．1 经过200W冷等离子体处理的黄芪的种子的发芽势、发芽率提高最大，分别比对照提高27.61% 和16.01% ，说明经过冷等离子体处理后，黄芪种子发芽势大幅提高，发芽率亦有所提高，田间出苗快且整齐，实现了亲本材料的苗齐苗壮。

5．2 经过冷等离子体处理的黄芪地上部分分枝数或株高提高，处理功率200W时，30日苗龄T1测定的株高提高23.08% ，分枝提高27.66% ，此时株高和分枝数均到达峰值；此功率T2株高提高22.89% ，分枝提高24.19% 。说明冷等离子体处理促进了幼苗的快速生长，生长势旺盛，实现了亲本材料的促生复壮，苗期优势可以遗传到T2代。

5．3 当处理功率为200W时，经过冷等离子体处理的黄芪在T1和T2，其主根长、主根粗、根鲜重均优于对照，可作为遗传育种中改良根系的最佳处理方案。

种植供选择自交系用的基本材料，建立原始材料圃，根据目标性状选择优良株系。通过群体内植株杂交，回交、测交等选择优良株系，建立杂交选育圃。把根系长势、产量作为自交系选育的依据，在群体改良过程中，每一步都应根据育种目标的要求，为新品种选育服务。按照育种目标，从杂交选育圃中，选出单株或一定数量外形近似的优良个体（单株、单穗），进行混合收获、脱粒、种植，建立混合选育圃，多代种植直至稳定。选育出的优良株系，建立鉴定圃，在鉴定圃内进行初级的产量比较，同时进行抗性鉴定，进行供试品种初选。将种植鉴定圃选出的优良品系，进行种植，建立品比圃，品系比较试验在较大面积上进行的更为精确、更有代表性的鉴定试验，对新品系的纯度、丰产性、熟性、稳定性、抗逆性等育种目标进行更为详细的鉴定。将获得的新品种进行区域试验、生产示范和品质检测等，之后进行品种技术鉴定，新品种选育工作完成。