重庆烟区烟草靶斑病病原菌鉴定及菌丝融合群分析

黄可珍，靳瑞瑞，陈 姗，张 帅，秦平伟，孙现超，陈国康，陈海涛

1. 西南大学植物保护学院，重庆市北碚区天生路2 号 400715

2. 中国烟草总公司重庆市公司酉阳分公司，重庆市酉阳县钟多镇和平路99 号 409800

3. 中国烟草总公司重庆市公司彭水分公司，重庆市彭水县绍庆街道阿依路111 号 409600

4. 中国烟草总公司重庆市公司烟叶分公司，重庆市江北区五江路20 号 400023

烟草靶斑病是一种烟草叶部病害，感染该病害的烟叶形成有同心轮纹的不规则病斑，病斑后期破裂穿孔。该病害具有潜育期短、流行速度快的特点，在温暖湿润条件下可反复侵染、大面积传播，防治难度大［1］，严重影响烟叶产量和质量，一旦流行会造成巨大的经济损失［2］。烟草靶斑病于2005年在我国辽宁丹东被发现［3］，随后迅速蔓延至全国各烟区［4-5］。该病害病原菌的有性世代为瓜亡革菌［Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk］，无性世代为立枯丝核菌（Rhizoctonia solaniKühn）。立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）是一个复合种，根据菌丝融合分类法［6］可将其划分为不同的融合群，已报道的立枯丝核菌融合群共有14 个（AG-1～AG-13 和AG-BI）［7］，其中，引起烟草靶斑病的融合群为AG-2、AG-3、AG-4、AG-5 和AG-6［8-10］。关于烟草靶斑病病原菌融合群的相关研究已有报道。例如，Sun 等［10］通过形态学和rDNA-ITS 序列分析明确引起贵州毕节烟草靶斑病的病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-6 融合群。徐传涛等［11］对四川泸州烟草靶斑病病原菌进行了分离、鉴定，发现该病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），经测定将其归为AG-3融合群。2021至2022年重庆市涪陵区武陵山乡、武隆区接龙乡、酉阳土家族苗族自治县、彭水苗族土家族自治县等烟区均发生了烟草靶斑病，为明确这些烟区烟草靶斑病的病原菌，采集发病株的典型发病叶片，采用组织分离法对病原菌进行分离、纯化，通过形态学观察及分子生物学分析对病原菌进行鉴定，并调查重庆主要烟区烟草靶斑病的发生情况，以期掌握烟草靶斑病在重庆烟区的危害特点，为该病害的科学防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试烟草品种为云烟87。用于病原菌分离的烟草病叶样品采集于重庆黔江区水市乡、武隆区接龙乡、涪陵区武陵山乡、万州区孙家镇、酉阳土家族苗族自治县、彭水苗族土家族自治县烟区烟田的感病烟株。立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-2-1、AG-3 融合群标准菌株保存于西南大学植物保护学院。

1.2 试验方法

1.2.1 病害调查

参照文献［12］的方法，于2022 年5 月至8 月对重庆市黔江区水市乡、武隆区接龙乡、涪陵区武陵山乡、万州区孙家镇、酉阳土家族苗族自治县、彭水苗族土家族自治县烟草靶斑病的发生时间及烟株发病率进行调查。

1.2.2 病原菌的分离和纯化

采用常规组织分离法［13］分离病原菌。取病健交界处叶片组织，将其剪成小块，经75%（体积分数）乙醇和5%（质量分数）次氯酸钠溶液消毒后，用无菌水漂洗3次。消毒后的叶片组织接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中黑暗培养，待菌落长出后将菌丝挑取至新的PDA 培养基上纯化培养5 d，获得纯化菌株。将纯化菌株转移到PDA斜面试管中保存。

1.3 纯化菌株的致病性测定

将保存的菌株转到PDA 培养基上，于28 ℃恒温条件下培养5 d，按照柯赫氏法则对其致病性进行验证。采用菌丝块接种法［14］，对健康云烟87 叶片进行有伤接种。选取5～6 叶期烟株中下部叶片，用无菌针头刺4 个小孔，再用打孔器取直径为5 mm 的菌丝块，菌丝面朝下置于叶片伤口处，将棉花用无菌水湿润后覆盖在菌丝块上保湿，对照处理接种直径为5 mm 的无菌PDA 培养基块。每个处理接种2 片叶，重复3 次。将接种后的烟株置于28 ℃恒温温室中，叶片发病后，于病健交界处分离病原菌进行鉴定。

1.4 菌丝融合群的鉴定

采用玻片对峙法［15］将1.2 节中的纯化菌株与立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-2-1、AG-3融合群标准菌株进行对峙培养，24 h后观察其菌丝融合情况。

1.5 病原菌的16S rDNA扩增及序列分析

随机选取13 个纯化菌株在PDA 培养基上于28 ℃条件下培养，7 d 后刮取菌丝，采用翌圣生物科技（上海）股份有限公司真菌基因组DNA 提取试剂盒提取病原菌DNA，提取过程严格按照说明书操作。采用真菌核糖体基因内转录间隔区通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）对病原菌的rDNA-ITS 序列进行扩增。PCR 扩增反应体系（25 μL）：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL PCR 产物用1%（质量分数）琼脂糖凝胶进行电泳检测，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司对扩增产物测序。将得到的序列使用NCBI网站的Blastn在线工具进行同源性比对，并下载相关菌株的基因序列，利用MEGA 11软件以邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 病害调查及病原菌的分离和纯化

经调查发现，黔江区水市乡、武隆区接龙乡、涪陵区武陵山乡、万州区孙家镇、酉阳土家族苗族自治县、彭水苗族土家族自治县均有烟草靶斑病发生。其中，彭水苗族土家族自治县烟株发病时间为5 月中下旬，酉阳土家族苗族自治县烟株发病时间在6月上旬，黔江区水市乡烟株发病时间为6月上旬，万州区孙家镇、涪陵区武陵山乡和武隆区接龙乡烟株发病时间为7月中下旬。该病害在酉阳土家族苗族自治县和彭水苗族土家族自治县的烟株发病率为40%～60%，而其他烟区该病害并未大面积流行，烟株发病率为5%～15%。对采集的病叶进行病原菌分离、纯化，共获得79 个菌株，详细信息见表1。病原菌在PDA 培养基上生长时，菌落初期为白色，后变为黄褐色（图1A），菌丝间夹角呈锐角或直角，分支处有明显缢缩，且分支附近有隔膜，不产生孢子（图1B），与Parmeter 等［6］描述的立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）形态特征一致。

表1 病原菌的分离株及其地理来源Tab.1 Isolates of pathogenic fungi and their geographical origins

图1 Rhizoctonia solani菌落及菌丝形态特征Fig.1 Morphological characteristics of fungal colonies and mycelia of Rhizoctonia solani

2.2 纯化菌株的致病性测定

代表菌株YYCL11 的致病性测定结果显示，健康烟草叶片在接种菌丝块3 d后开始发病，前期病斑为不规则水渍状，有明显同心轮纹，且周围伴有褪绿晕圈，后期病斑中心穿孔（图2C），与病害调查发现的田间发病叶片症状一致（图2A、图2B），对照未发病（图2D）。从接种发病的烟叶中再次分离、纯化得到的菌株菌落形态及菌丝形态与菌株YYCL11 相同，证明菌株YYCL11对烟草叶片具有致病性，是引起重庆烟区烟草靶斑病的病原菌。

图2 烟草靶斑病田间症状及菌株YYCL11的致病性测定Fig.2 Field symptoms of tobacco target spot and pathogenicity determination of strain YYCL11

2.3 菌丝融合群的鉴定

通过玻片对峙法，测定纯化菌株与立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-2-1、AG-3 融合群标准菌株的菌丝融合情况，发现采集自重庆万州区孙家镇、黔江区水市乡、武隆区接龙乡、涪陵区武陵山乡、酉阳土家族苗族自治县和彭水苗族土家族自治县的烟草靶斑病病原菌菌株均可与AG-3 融合群标准菌株的菌丝融合（图3A），但不与AG-2-1 融合群标准菌株的菌丝融合（图3B）。

图3 菌丝融合群测定Fig.3 Determination of anastomosis group

2.4 病原菌的16S rDNA扩增及序列分析

对选取的13 个纯化菌株DNA 的ITS 区域进行扩增，得到的片段长度大约为710 bp。Blastn 同源性比对结果显示，13 个菌株的rDNA-ITS 序列与立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）或其有性世代瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris）的同源性高达97%～100%。以Rhizoctonia solaniAG-6 作为外群，使用MEGA 11 软件以邻接法构建系统发育树（图4），结果显示13个菌株与Rhizoctonia solaniAG-3以97%的支持率聚于同一分支上。

图4 基于16S rDNA构建的13个菌株的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of 13 isolates of Rhizoctonia solani based on 16S rDNA sequences

3 讨论

本研究中调查的6 个烟区均有烟草靶斑病发生，可能是由于这些烟区为高海拔山区，6 至7 月份常出现连续降雨的情况，导致空气湿度大、温度偏低，有利于该病害在田间迅速流行。通过形态学观察及分子生物学分析发现，引起重庆烟区烟草靶斑病的病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-3融合群，而引起四川宜宾烟草靶斑病的立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）为AG-5融合群［9］，引起广西罗城烟草靶斑病的病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-2 和AG-4 融合群［16］。引起不同烟区烟草靶斑病的立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）隶属于不同菌丝融合群，这可能与地理环境及烟草品种等因素有关，但具体原因还有待进一步研究。

4 结论

通过病害调查发现烟草靶斑病在重庆市武隆区接龙乡、涪陵区武陵山乡、黔江区水市乡、酉阳土家族苗族自治县和彭水苗族土家族自治县均有发生。从这些烟区的发病烟株上采集的病叶通过分离、纯化及致病性测定后，得到79 个病原菌菌株，通过病原菌的形态特征观察，将病原菌鉴定为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）。通过菌丝融合群测定以及rDNA-ITS基因序列系统进化树分析，明确病原菌归属于AG-3 融合群，且病原菌菌株与Rhizoctonia solaniAG-3 的同源性达97%以上。因此，确定引起重庆烟区烟草靶斑病的病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-3融合群。