中医干预心肌缺血再灌注大鼠疗效及PI3K-Akt/Bax/Bcl信号通路影响的Meta分析

葛腾 齐鸿飞 宁博 吴永青 赵明君

心血管疾病发病率已经成为我国患病率之首,据统计2019年患病人数已经达到3.3亿[1],其中缺血性心肌病占居民疾病死亡的40%以上,居于首位[2]。目前治疗该病最有效的措施是及时恢复血流灌注,但越来越多的证据表明心肌细胞在血液灌注恢复后更容易发生损伤,而且情况更加严重甚至出现不可逆的损害,这种现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI),目前只能抗氧化、减轻钙超载等治疗,仍无特效治疗药物[3]。中医认为此病属于“胸痹”“心悸”等范畴,病机主要为本虚标实。因血管长时间闭塞不通而致心失濡养,阳气亏虚则发心中悸动不安,出现心律失常;虽复流后血流通畅,但正气虚弱不能推动血流运行,故再发胸痛,正如《金匮要略》所曰:“胸痹而痛,所以然者,则其极虚故也”,甚至气、血、津、液凝聚不通,出现细胞水肿、凋亡现象。研究表明中医治疗MIRI具有一定的优势性[4],因此探索中医药治疗MIRI各方面指标的疗效和作用机制尤为重要。近年来越来越多的研究已经证明中医干预MIRI大鼠模型疗效及调控磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase,PI3K/Akt)信号通路有效,但各个研究样本较少,难以得出明确结论。虽已有Meta分析讨论MIRI与PI3K/Akt关系,但干预措施限制为益气活血养阴类中药,研究时间已超出5年。故本研究收集国内外基于大鼠实验对中医干预MIRI的疗效和PI3K/Akt通路表达进行分析与探讨,对已有评价进行补充分析,并为中医治疗MIRI和未来研究提供有价值的循证医学证据。

1 资料和方法

1.1 搜索策略

检索Cochrane Library、Pubmed、Embase、CNKI、VIP、Wanfang、CBM主流数据库,检索从建库至2022年9月20日。中文以主题结合自由词检索,包括:“中医”“中药”“心肌缺血再灌注”“大鼠”“PI3K”等词;英文检索词包括:“Traditional Chinese Medicine”“myocardial ischemia reperfusion”“PI3K”“animal”等词,因预检索英文数据库采用主题搜索,文献较少。故本次英文数据库检索采用全文式搜索,降低漏检率,具体检索方式见表1。

表1 文献检索方式

1.2 纳入标准

(1)原始研究为公开发表的研究,包括期刊、学位论文等文献,有独立的随机治疗组与对照组;(2)研究对象为不限种类的MIRI大鼠模型;(3)治疗组干预措施为不限种类的中医疗法;(4)研究内容清晰、数据完整可提取;(5)MIRI大鼠模型必须符合《医学实验动物学》心肌缺血再灌注相关造模标准[5]。

1.3 排除标准

(1)重复发表的研究;(2)无独立IR对照组的研究;(3)无体内研究,单独的离体研究;(4)对照组或治疗组采用多种干预措施无法对比中医疗效。

1.4 结局指标

常规指标:血清肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB, CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α);根据PI3K/Akt信号通路选取心肌组织蛋白磷酸化丝苏氨酰蛋白激酶B(protein kinase B,Akt) (P-akt)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bax)的蛋白表达量。

1.5 文献提取与质量评价

1.5.1 文献提取 根据上述检索后导入NoteExpress,两名研究者独立筛选、提取数据,若出现分歧由第三方介入解决。纳入文献特征表包括:文献基础信息(第一作者、发表年份);研究对象(模型类型、体质量);研究内容(分组方法、干预措施、周期);结局指标。

1.5.2 文献质量评估 两位研究者采用动物实验风险偏倚SYRCLE工具进行评估[6],如出现分歧由第三方介入解决。SYRCLE工具表包括选择、实施、测量、失访、报告、其它6种偏倚,每个领域分为“是”“否”“不确定”分别代表“低风险”“高风险”“不确定”。

1.5.3 统计学分析 应用Stata 16软件进行Meta分析,连续性变量选用标准化均数差(SMD)表示效应值,和95%置信区间(95%,CI)表示。利用连续性变量亚组合并公式合并亚组数据,合并后总样本N=N1+N2,总均数M=(N1M1+N2M2)/(N1+N2),总标准差SD,公式如下:

用I2来判定异质性大小,若I2<50%或P>0.05提示各项研究不存在异质性,Meta分析采用固定效应模型(fixed effects model,FEM),若I2>50%或P<0.05提示各项研究存在异质性,Meta分析采用随机效应模型(random effects model,REM),对于异质性来源首先检查数据是否错误,必要时可用敏感性分析或描述性分析。最后对于纳入研究文献≥10篇的结局指标采取敏感性分析讨论数据是否可靠,利用剪补法绘制漏斗图来分析发表偏倚情况。

2 结果

2.1 纳入文献

根据上述的纳入与排除标准,对检索的文献进行核查筛选。检索中、英数据库共得199篇研究,剔除重复研究后对剩余的166篇标题、摘要进行筛选,剔除98篇文献,68篇文献进行全文审阅,最终有30篇文献纳入本Meta分析,其中中文28篇、英文2篇,筛选流程见图1。

图1 文献筛选流程及结果

2.2 纳入文献基本特征

30项研究中28项[7-11,13-17,19-36]中文研究、2项[12,18]英文研究,共涉及684只大鼠,研究地点均在中国。5项研究使用Wistar大鼠[15,18,26-28],25项[7-14,16-17,19-25,29-36]研究使用SD大鼠。除1项研究[14]造建MIRI+OVX模型外其余均为MIRI。根据给药浓度划分,5项[15,23,26,30,36]研究有2个亚组,7项[8,11,13,14,28,32,35]研究有3个亚组。中医干预包括中药提取物/单体、中药注射剂、中药复方、针刺。大鼠体质量大多在200～300 g之间,11项研究[13,18,22-23,25,29-32,34-35]治疗疗程在造模期间完成,19项研究[7-12,14-17,19-21,24,26-28,33,36]疗程天数不等,文献基本特征见表2。

表2 纳入文献基本特征

2.3 纳入文献风险偏倚评价

根据SYRCLE偏倚风险工具评估纳入的30项研究,共10项调查,评估结果为低风险得一分,共10分。本次纳入研究的得分为4～6分。6项获得4分(20%),22项获得5分(73%),2项获得6分(7%),具体见表3。

表3 纳入文献偏倚风险评估表

2.4 Meta分析

12项文献根据给药浓度进行亚组研究,为更加全面、准确分析中医干预疗效,故合并同一干预措施的不同浓度亚组数据,将合并后的总数据进行Meta分析。

2.4.1 血清cTnI量 8项[7,10,13,22,24-25,29,36]研究报告治疗后大鼠血清cTnI改善情况,各研究间存在异质性(I2=80.3%,P<0.001)采用随机效应模型合并统计量,结果显示与对照组相比,治疗组明显降低大鼠血清cTnI,差异具有统计学意义(SMD=-2.45,95%CI[-3.46,-1.44],P<0.001),见图2a。其中2项研究[10,24]敏感性分析后发现可信区间与其它研究差距较大,剔除后进行Meta分析示各研究间异质性无统计学意义(I2=52.6%,P>0.05),故采用固定效应模型合并剔除后研究的统计量,结果表明与未剔除之前结果一致,差异具有统计学意义(SMD=-1.5,95%CI[-1.92,-1.08],P<0.001),见图2b。表明剔除的2项研究为此项结局指标异质性的主要来源。

图2 中医干预MIRI模型大鼠血清cTnI的Meta分析

2.4.2 血清CK-MB量 15项[7,10,12,14-15,19-20,22-24,26,28-30,32]研究报告治疗后大鼠血清CK-MB改善情况,各研究间存在异质性(I2=86.4%,P<0.001)采用随机效应模型合并统计量,结果显示与对照相组比,治疗组明显降低大鼠血清CK-MB,差异具有统计学意义(SMD=-2.47,95%CI[-3.25,-1.68],P<0.001),见图3a。其中3项研究[10,23,28]敏感性分析后发现可信区间与其它研究差距较大,剔除后进行Meta分析示各研究间异质性无统计学意义(I2=0,P>0.05),故采用固定效应模型合并剔除后研究的统计量,结果表明与未剔除之前结果一致,差异具有统计学意义(SMD=-1.53,95%CI[-1.81,-1.25],P<0.001),见图3b。表明剔除的3项研究为此项结局指标异质性的主要来源。

图3 中医干预MIRI模型大鼠血清CK-MB的Meta分析

2.4.3 血清LDH量 13项[10,12-13,14-15,20-21,26,28-30,32,35]研究报告治疗后大鼠血清LDH改善情况,各研究间存在异质性(I2=90.5%,P<0.001)采用随机效应模型合并统计量,结果显示与对照相组比,治疗组明显降低大鼠血清LDH,差异具有统计学意义(SMD=-3.24,95%CI[-4.28,-2.21],P<0.001),见图4a。其中2项研究[10,28]敏感性分析后发现可信区间与其它研究差距较大,剔除后进行Meta分析示各研究间异质性仍存在(I2=80.2%,P<0.05),故采用随机效应模型合并剔除后研究的统计量,结果表明与未剔除之前结果一致,差异具有统计学意义(SMD=-2.22,95%CI[-2.92,-1.52],P<0.001),见图4b。表明剔除的2项研究为异质性的部分来源,其还可能与大鼠对药物敏感度、测量仪器灵敏度、大鼠体质量等有关。

图4 中医干预MIRI模型大鼠血清LDH的Meta分析

2.4.4 血清SOD量 6项[13-15,22,32,35]研究报告治疗后大鼠血清SOD改善情况,各研究间存在异质性(I2=65.1%,P<0.05)采用随机效应模型合并统计量,结果显示与对照组相比,治疗组明显改善大鼠血清SOD,差异具有统计学意义(SMD=1.75,95%CI[1.09,2.41],P<0.001),见图5。

图5 中医干预MIRI模型大鼠血清SOD的Meta分析

2.4.5 血清TNF-α量 7项[11,13,15,16,22,27,29]研究报告治疗后大鼠血清TNF-α改善情况,各研究间存在异质性(I2=90.3%,P<0.001)采用随机效应模型合并统计量,结果显示与对照组相比,治疗组明显降低大鼠血清TNF-α,差异具有统计学意义(SMD=-3.55,95%CI[-5.17,-1.93],P<0.001),见图6。

图6 中医干预MIRI模型大鼠血清TNF-α的Meta分析

2.4.6 心肌组织蛋白P-akt表达 10项[9,11,16-18,20,31-33,36]研究报告治疗后大鼠心肌组织蛋白P-akt改善情况,各研究间存在异质性(I2=87%,P<0.001)采用随机效应模型合并统计量,结果显示与对照组相比,治疗组明显上调大鼠心肌组织蛋白P-akt表达,差异具有统计学意义(SMD=5.53,95%CI[3.85,7.21],P<0.001),见图7。敏感性分析后发现所有研究结果的可信区间差异性小,故异质性主要来源可能与大鼠对药物敏感度、测量仪器灵敏度、大鼠体质量等有关。

图7 中医干预MIRI模型大鼠心肌组织蛋白P-akt的Meta分析

2.4.7 心肌组织蛋白PI3K表达 3项[8,10,34]研究报告治疗后大鼠心肌组织蛋白PI3K改善情况,各研究间存在异质性(I2=70.5%,P<0.05)采用随机效应模型合并统计量,结果显示与对照组相比,治疗组明显上调大鼠心肌组织蛋白PI3K表达,差异具有统计学意义(SMD=11.85,95%CI[7.12,16.57],P<0.001),见图8。

图8 中医干预MIRI模型大鼠心肌组织蛋白PI3K的Meta分析

2.4.8 心肌组织蛋白Bax表达 6项[10-11、14,16,20,36]研究报告治疗后大鼠心肌组织蛋白Bax改善情况,各研究间存在异质性(I2=89.2%,P<0.001)采用随机效应模型合并统计量,结果显示与对照组相比,治疗组明显下调大鼠心肌组织蛋白Bax表达,差异具有统计学意义(SMD=-5.3,95%CI[-7.62,-2.98],P<0.001),见图9。

图9 中医干预MIRI模型大鼠心肌组织蛋白Bax的Meta分析

2.4.9 心肌组织蛋白Bcl-2表达 7项[10-11,14,16,20,23,36]研究报告治疗后大鼠心肌组织蛋白Bcl-2改善情况,各研究间存在异质性(I2=94.3%,P<0.01)采用随机效应模型合并统计量,结果显示与对照组相比,治疗组明显上调大鼠心肌组织蛋白Bcl-2表达,差异具有统计学意义(SMD=3.7,95%CI[1.3,6.09],P<0.001),见图10。

图10 中医干预MIRI模型大鼠心肌组织蛋白Bcl-2的Meta分析

2.5 敏感性分析

对纳入10篇及以上文献的3项结局指标血清CK-MB、LDH、心肌组织蛋白P-akt进行敏感分析,逐一剔除每项研究后查看结局是否发生变化,详见图11。血清CK-MB指标中有3项研究与其它差异较大,LDH指标中有2项研究与其它差异较大,而心肌组织蛋白P-akt指标结果较为集中。敏感性分析结果表明以上3项结局指标均不会因为剔除某项研究而发生结局指标的变化,表明Meta分析结论可靠。

注: a为CK-MB敏感性分析;b为LDH敏感性分析;c为P-akt敏感性分析。

2.6 发表偏倚分析

对纳入10篇及以上文献的3项结局指标血清CK-MB、LDH、心肌组织蛋白P-akt进行发表偏倚分析,采用Egger’s test,若P<0.05提示存在发表偏倚,进一步利用剪补法添加虚拟数据后分析是否会逆转此项结局指标。

2.6.1 血清CK-MB偏倚分析 对纳入15篇文献的血清CK-MB结局指标进行偏倚分析后表明偏倚存在(Egger’s test t=-5.76,P<0.05),进一步使用剪补法分析,添加2篇虚拟数据后随机效应结果(SMD=-2.85,95%CI[-3.71,-2.00])与未添加前血清CK-MB的随机效应结局无逆转(SMD=-2.47,95%CI[-3.25,-1.68]),故此项指标虽存在发表偏倚但结局依然稳健。见图12。

图12 中医干预MIRI模型大鼠血清CK-MB的剪补漏斗图

2.6.2 血清LDH偏倚分析 对纳入13篇文献的血清LDH结局指标进行偏倚分析后表明偏倚存在(Egger’s test t=-7.14,P<0.05),进一步使用剪补法分析,添加1篇虚拟数据后随机效应结果(SMD=-3.69,95%CI[-4.93,-2.4])与未添加前血清LDH的随机效应结局无逆转(SMD=-3.24,95%CI[-4.28,-2.21],故此项指标虽存在发表偏倚但结局依然稳健。见图13。

图13 中医干预MIRI模型大鼠血清LDH的剪补漏斗图

2.6.3 心肌组织蛋白P-akt偏倚分析 对纳入10篇文献的心肌组织蛋白P-akt结局指标进行偏倚分析后表明偏倚存在(Egger’s test t=6,P=<0.05),进一步使用剪补法分析,但未添加虚拟数据,随机效应结果(SMD=5.53,95%CI[3.85,7.21]),故此项指标虽存在发表偏倚但结局依然稳健。见图14。

图14 中医干预MIRI模型大鼠心肌组织蛋白P-akt的剪补漏斗图

3 讨论

3.1 分析总结

本项研究表明中医药疗法能显著降低MIRI大鼠模型的cTnI、CK-MB、LDH、TNF-α血清含量与Bax心肌组织蛋白表达,并提升SOD血清含量与P-akt、PI3K、Bcl-2心肌组织蛋白表达。其中cTnI已被广泛应用于心肌梗死诊断中,是心肌受损过程中的高特异性指标,在心肌受损早期cTnI可快速入血,血清中cTnI急速上升[37],故称其为梗死金指标;血清CK-MB在正常人体中水平较低,发生心肌受损时CK-MB从心肌进入血清中显著升高[38],故作为急性心梗的重要诊断与预后指标;LDH是存在于心肌组织中的一种代谢酶,心肌细胞损伤时血清LDH升高,而LDH升高会进一步加剧心肌细胞损害从而陷入恶性循环[39];TNF-α是一种可诱导心肌细胞凋亡的炎症因子,参与心室重构,在心肌梗死后水平显著增加[40];SOD是一种自由基清除剂,在发生MIRI时,SOD可清除大量氧自由基,保护心肌细胞免受自由基的损伤,维持机体内的抗氧化平衡[41-42];而Bax与Bcl-2蛋白是一对相互拮抗的凋亡与抗凋亡蛋白,属PI3K/Akt通路下游靶蛋白[43]。正常人体心肌细胞处于凋亡与抗凋亡的动态平衡中,主要依靠Bax/Bcl-2蛋白比值决定。其中Bax属于促凋亡蛋白,Bcl-2属于抗凋亡蛋白,二者相互拮抗,通过形成二聚体调控细胞凋亡。Bax/Bcl-2比值高时,同源二聚体形成较多,可促进细胞凋亡,Bax/Bcl-2比值低时,异源二聚体形成较多,可抑制细胞凋亡[44]。在MIRI刺激下,Bad蛋白与分子伴侣蛋白裂解,使Bax表达上调,激活细胞凋亡程序。而Akt活化后将Bad蛋白的Ser136磷酸化与Bax竞争结合分子伴侣蛋白14-3-3,从而使Bax蛋白失去诱导凋亡能力[45],见图15。

图15 PI3K-Akt/Bax/Bcl 调控细胞凋亡信号通路图

因此,本文对30项中外研究中医干预MIRI大鼠模型的cTnI、CK-MB、LDH、TNF-α、SOD血清含量进行分析,目的为评价中医治疗的有效性,对P-akt、PI3K、Bax、Bcl-2心肌组织蛋白表达进行分析,目的为评价中医治疗MIRI的机制。基于此,本研究对中医相关疗法通过PI3K-Akt/Bax/Bcl信号通路以改善患者心肌缺血再灌注后心肌细胞损伤为目的,从心肌细胞损伤的生化指标与通路蛋白的表达2个方面进行Meta分析,不仅论证了中医治疗MIRI的有效性,而且为中医相关机制研究增加了循证学依据,见图16。

图16 本文分析流程图

3.2 研究局限性及异质性来源

本项研究纳入总文献30篇,英文文献占2篇,未纳入其他语言文献,且研究地点均在中国,实验模型均为大鼠,纳入文献质量评分较低,总体样本数量较少,异质性较大,Egger运算仍有偏倚存在。对于异质性来源本文仅探讨纳入≥8篇文献的结局指标4项,其中2项研究异质性来源为文献间差距较大,去除相关文献后无异质性。另外2项研究主要异质性来源不知,可能与以下几点有关:(1)中医干预措施不同,治疗效果不同;(2)所纳入研究大鼠样本量不一,存在大量小样本研究;(3)大鼠对药物敏感性不同;(4)测量仪器精准度不同。

此次研究总结补充中医不同疗法治疗MIRI在不同指标方面的疗效,其机制可能与PI3K-Akt/Bax/Bcl信号通路有关。但结论的准确性仍需更高质量、更大样本的动物实验来给予验证。