急性心肌梗死对心脏发育基因SOX9及血清炎性因子的影响

樊涟漪,邓胜利

(1.空军军医大学第二附属医院 骨科麻醉,陕西 西安 710038;2.遵义医科大学 麻醉医学院,贵州省麻醉与器官重点保护实验室,贵州 遵义 563099;3.遵义医科大学附属医院 麻醉科,贵州 遵义 563099)

缺血性心脏病目前是人类死亡的主要原因之一,而心肌梗死(myocardial infarction,MI)尤其急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是缺血性心脏病最常见原因,它发病骤急,患者预后极差［1]。

SOX家族蛋白是一组具有高度保守结构域的转录调控子,SOX9的下调可导致心室心肌细胞减少,影响心肌的正常生长［2],另缺失SOX9的胚胎大多在妊娠中期即死亡,其原因可能是由于心内膜垫细胞迁移受阻和凋亡增加［3],导致此类胚胎心内膜垫严重发育不良,诱发充血性心衰。随后研究发现,SOX9是心肌缺血损伤后导致后期心脏纤维化的主要调控因子［4]。近来文献报道缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)过表达时SOX9表达增加,而HIF-1已被证实可通过多种途径发挥心肌保护效应［5]。还有研究认为,SOX9可调控与心肌缺血密切相关的AP-1、Wnt等基因［6-9]。以上研究提示SOX9可能与心肌的缺血损害存在一定相关,明确它们之间关系可能会对寻找抗心肌缺血损害的治疗靶点提供新思路。

目前众多的研究证实,SOX9与炎性反应的调控有关［10],但其研究却表现出不同的观点与结果。在肝脏方面研究认为,抑制SOX9可减少白介素6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor a,TNF-α)等炎性因子的释放,进而减轻炎症反应导致的肝缺血损伤［11];在软骨细胞炎症中研究发现,SOX9表达的上调与血清IL-6等炎性因子的增高呈正比［12],即SOX9的表达与炎性反应呈正相关。然在牙髓炎的研究中,敲除SOX9却可导致白介素8(interleukin 8,IL-8)表达增加,加速诱导炎症反应的发生［13],呈现负相关。但在发生AMI时,心肌SOX9与炎性因子及心肌损害标志物之间的关系如何尚未见报道。

基于上述原因,本研究通过建立大鼠心肌梗死模型,观察AMI缺血不同时间对心肌SOX9的表达变化及血清高敏肌钙蛋白(high-sensitivity cardiac troponin, hs-cTn)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)等心肌损害标志物与IL-6、TNF-α炎性因子的改变;同时测量心肌梗死面积,观察线粒体超微结构,以明确SOX9与急性心肌缺血损害、心肌损害标志物及炎性因子之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 本实验选用健康SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,实验时体重250～300 g,周龄为8～9周。按照随机数字表法分为两组,分别建立急性心肌梗死模型与假手术模型:心肌梗死组(MI组,n=45)与假手术组(Sham组,n=36)。两组模型建立成功后又随机分为0.5、8、24 h进行各项指标的检测。Sham组各时点大鼠建模各12只,共36只均存活。MI组0.5 h时点建模15只,存活13只;8 h时点建模15只,存活12只;24 h时点建模15只,存活11只;MI组总体死亡9只。

1.2 主要试剂及仪器 2、3、5 氯化三苯基四氮唑(2、3、5-triphenytetrazoliumchloride,TTC)、酶联免疫吸附测定试剂盒(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA,北京索莱宝科技有限公司);蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);兔多抗SOX9(艾博抗上海贸易有限公司);ALC-V8型小动物呼吸机、JEM-1400plus型透射电子显微镜、Varioskan Flash型多功能酶标仪、稳压稳流电泳仪、垂直电泳仪、湿转转膜仪。

1.3 方法

1.3.1 心梗模型的建立 建立MI模型:参照文献［14]建立。MI模型:采用2%戊巴比妥钠(3 mL/kg)对大鼠进行腹腔内注射麻醉。行气管插管成功后连接呼吸机,呼吸机参数设置为呼吸频率:80次/min,潮气量为15 mL/kg,吸呼比为1∶1,吸入95%氧气与5%二氧化碳混合气体;消毒铺巾,于大鼠左侧胸壁3～4肋间下横向开胸,逐层暴露心脏,在冠状动脉左侧主干处、左心耳下方2～3 mm处位置,将冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)用6.0带线缝合针穿过并结扎(进针深度1～1.5 mm,宽约2.0 mm)。结扎后即刻可见:结扎区域及左室前壁心肌组织变白,心电图显示ST段抬高,此为心梗建模成功的标志;而假手术对照组则只对LAD血管穿线不结扎。术毕用青霉素10万U肌肉注射预防感染。

1.3.2 TTC染色法检测大鼠心肌梗死面积 称取0.1 g TTC 37 ℃恒温孵育约25 min;将剪取的心脏置于-80 ℃冰箱中冷冻7～8 min;均匀横切至5～7片,于37 ℃1%TTC染液中恒温染色15～20 min;置于4%多聚甲醛中固定,24 h后相机拍照备用;使用Image-J软件对照片进行测量分析,计算心肌梗死面积。其梗死面积(%)=心肌切片白色梗死面积/心肌切片左室总面积×100%。

1.3.3 透射电镜观察大鼠心肌线粒体超微结构 切取左室前壁中线靠近结扎区心肌组织,将标本切至1 mm×1 mm×1 mm大小,并置于4%的戊二醛ep管中固定,于透射电镜下进行心肌超微结构的检测。按Flameng标准进行评分。

1.3.4 ELISA法检测血清中hs-cTn、CK-MB、肌红蛋白(myoglobin,Mb)及IL-6、TNF-α的含量 按相关试剂盒说明书,通过ELISA法对血清中hs-cTn、CK-MB、Mb及IL-6、TNF-α等指标进行检测。

1.3.5 Western-blot法检测SOX9蛋白的相对表达量 根据试剂说明书提取心肌组织总蛋白,同时按步骤进行BCA法测蛋白浓度,将提取的蛋白变性后于-20 ℃保存,制备好电泳装置后,进行电泳、电转、封闭、抗体孵育后,最后曝光,应用ImageJ软件进行条带分析。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积的变化 Sham组各时间点未发生心肌梗死现象;MI组与Sham组相比,各时点两组之间比较均有统计学差异(P<0.05),MI组出现不同程度的心肌梗死灶;MI组内心肌梗死面积24 h时点大于8 h时点,8 h时点大于0.5 h时点,差异具有统计学意义(P<0.05),其心肌梗死面积呈现逐渐增加(图1、表1)。

图1 各组大鼠心肌梗死TTC染色结果

表1 各组大鼠心肌梗死面积结果

2.2 大鼠心肌线粒体超微结构的改变及心肌线粒体Flameng评分

2.2.1 心肌线粒体超微结构的变化 透射电镜下Sham组各时点线粒体数目较多,结构完整清晰、排列整齐,基质内电子密度高,肌纤维排列整齐;0.5 h时点MI组除线粒体基质内电子密度稍有降低外,余未见明显改变;8 h时点MI组线粒体数量减少,部分线粒体肿胀、膜结构消失,线粒体嵴变短变浅、断裂,基质内电子密度明显降低,肌纤维少部分溶解断裂;24 h时点MI组线粒体大部分溶解消失,所残存线粒体结构不清,内呈空泡状,肌纤维溶解断裂成团(图2)。

标尺分别为2 μm和1 μm。图2 各组大鼠心肌线粒体超微结构

2.2.2 心肌线粒体Flameng评分结果 Sham组各时点线粒体评分无统计学差异;MI组与Sham组相比,0.5 h时点线粒体评分无统计学差异(P>0.05),8 h及24 h时点线粒体评分明显增加(P<0.05);MI组内情况:与0.5 h时点相比,8 h及24 h时点线粒体评分增加,且24 h时点线粒体评分高于8 h时点(P<0.05,图3、表2)。

*:P<0.05。图3 各组大鼠心肌线粒体评分结果

2.3 各组大鼠血清中hs-cTn、CK-MB、Mb及IL-6、TNF-α的变化 Sham组各时点血清hs-cTn、CK-MB、Mb心肌损伤标志物与IL-6、TNF-α炎性因子检测量无统计学差异(P>0.05)。MI组与Sham组相比:8 h及24 h时点hs-cTn、CK-MB、Mb与IL-6、TNF-α均增加(P<0.05),但在0.5 h时点IL-6、TNF-α检测量增加(P<0.05),而hs-cTn、CK-MB、Mb无差异(P>0.05);MI组内情况:8 h及24 h时点所有心肌损伤标志物与炎性因子较0.5 h时点增加,且24 h时点较8 h时点高,差异均具有统计学意义(P<0.05,表3～7、图4)。

表2 各组大鼠心肌线粒体Flameng评分情况

表3 各组大鼠血清hs-cTn变化情况

表4 各组大鼠血清CK-MB变化情况

表5 各组大鼠血清Mb变化情况

表7 各组大鼠血清TNF-α变化情况

A、B、C:分别为心肌损伤标志物hs-cTn、Mb、CK-MB结果;D、E:分别为炎症指标IL-6、TNF-α结果;图4 各组大鼠血清中心肌损伤标志物及炎症指标检测结果

2.4 各组大鼠心肌组织中SOX9蛋白表达量的变化 Sham组各时间点大鼠心肌组织中SOX9 蛋白表达量无明显变化(P>0.05)。MI组与Sham组相比,在24 h时点心肌组织SOX9 蛋白表达量出现明显下降(P<0.05),在0.5 h及8 h时点无统计学差异(P>0.05);MI组内情况:与0.5 h时点相比,24 h时点大鼠心肌组织SOX9蛋白表达量明显下降(P<0.05),而8 h时点与0.5 h时点及24 h时点与8 h时点相比,蛋白下降差异无统计学意义(P>0.05,表8、图5)。

A:SOX9蛋白的免疫印迹图;B:SOX9蛋白表达量化结果;图5 各组大鼠心肌组织中SOX9蛋白表达量结果

2.5 大鼠心肌组织SOX9蛋白表达变化与血清炎症因子及心肌损伤标志物变化的相关性分析 AMI后24 h内,缺血心肌SOX9蛋白表达量随着缺血时间的延长而逐渐下降,血清炎性因子及心肌损伤标志物逐渐升高。SOX9蛋白水平的下降与血清炎性因子及心肌损伤标志物含量的上升呈负相关性(相关值分别为:hs-cTn,r=-0.641;CK-MB,r=-0.707;TNF-α,r=-0.722;IL-6,r=-0.684)(P<0.05,表9、图6)。

表9 24 h内AMI大鼠心肌SOX9蛋白表达量与血清炎症因子及心肌损伤标志物水平的相关性

图6 24 h内AMI大鼠心肌SOX9蛋白表达量与血清炎症因子及心肌损伤标志物变化的相关性分析

3 讨论

急性心梗后24 h内早期予以治疗可明显减少患者死亡率及远期并发症［15-18];同时对AMI的基础研究发现,心肌因缺血和缺氧,可迅速引发炎性因子风暴,影响患者预后。故深入研究AMI的病理生理改变及机制,可为治疗AMI寻求新的靶点。SOX9作为心脏发育基因,目前在AMI时的变化及相关作用不清。故本研究围绕大鼠24 h内AMI展开SOX9的相关研究。

目前关于大鼠MI模型的建立有冠脉结扎法［14],药物诱导法［19],冰烙法［20]等。冠脉血管结扎法更加明确可靠,与临床心梗更相符合,且模型相对稳定［14],故本实验选择冠脉结扎法进行MI的造模。而本研究的结果示血清心肌损伤标志物及心肌梗死面积等的增加与出现均证实MI模型的建立成功。

MI后出现不同程度的心梗面积,且心梗面积呈逐渐增加趋势,明确说明MI模型建立成功。同时发现MI后8 h及24 h线粒体发生明显破坏,且24 h较8 h破坏程度严重,说明缺血到达一定时间可导致线粒体损伤,并随缺血时间延长而逐渐加重。而本实验发现单纯开胸及心肌缺血0.5 h不会引起线粒体明显损害,这与既往报道一致［21]。关于在0.5 h时点,MI组出现通过TTC染色显示发生心梗,而线粒体超微结构未发生明显损伤这一“矛盾”现象。我们分析考虑可能主要与TTC染色判断心梗的原理有关,即TTC染色是通过组织中脱氢酶将氧化型TTC还原为还原型TTC使心肌表现为砖红色;一旦脱氢酶减少则TTC不能被还原而呈现白色。而有研究认为［22],心肌缺血30 min在线粒体结构未发生明显变化时琥珀酸脱氢酶含量则明显下降,也即在组织结构未发生明显改变时某些酶的活性或含量已经发生变化有关。是否还有其它原因目前不清。

临床常把心肌损伤标志物及炎性因子用于AMI的诊断与预后判断［23-24];有研究认为,它们还与心肌的缺血损害程度有关［25]。本实验结果表明伴随缺血时间的延长心肌损害逐渐加重,而心肌损伤标志物及炎性因子也呈逐渐上升趋势,该结果也表明AMI的心肌损害程度与上述指标变化存在密切相关,可用这些指标的变化来反映心肌的损害程度［25-26]。而关于本研究结果提示,IL-6、TNF-α炎性因子对AMI的缺血损害反应早于心肌损伤标志物。理论上可采用前述炎性因子来尽早反映心肌损害的发生,但因其特异性低,检测结果受影响因素较多［19, 27],故仍需采用心肌损伤标志物来对心肌损害的早期诊断与损伤程度进行判断。鉴于SOX9参与缺血后心肌细胞的肥大与纤维化调控,还通过上调HIF-1对抗高糖诱导的心肌细胞损害。那么SOX9是否直接涉及AMI后心肌的缺血损伤目前不清,我们构建MI模型,拟探讨SOX9与急性心肌缺血损害的关系。

本实验对心肌SOX9蛋白的检测结果显示,MI组在0.5 h与8 h时点蛋白水平虽有量的持续下降,但无统计学差异,直至缺血24 h时点才出现明显降低。尽管如此,我们仍发现SOX9的下降与心肌的缺血损伤有关。关于AMI后SOX9的表达水平下降其机制本研究暂未涉及。但有学者发现,在人椎间盘细胞炎性反应中,炎症因子的增加可通过抑制NF-κB信号通路的激活进而下调SOX9表达［28],而本研究炎性因子的结果示心肌梗死后IL-6及TNF-α的含量呈进行性的升高,这可能同样是导致AMI时其心肌SOX9表达水平下降的原因之一。当然明确这一机制需进一步通过抑制炎性反应的实验来予以直接证明。

为了明确AMI时,心肌SOX9蛋白的变化与血清心肌损伤标志物及炎性因子的关系,我们作了相关性分析。结果显示,24 h内MI组各时间点hs-cTn、CK-MB及IL-6、TNF-α的变化与SOX9蛋白水平的改变呈负相关性。说明心肌SOX9表达的下调与血清心肌损伤标志物及炎性因子的升高在AMI中存在某种内在关联,如前面推测的炎性因子可能是导致AMI时SOX9表达水平下降的原因等。但它们之间的具体内在关联为何目前不清。但既往研究证实心肌损伤标志物及炎性因子的变化与心肌的损害程度存在正相关［25-26],我们的研究结果也得到相同结论。故通过它们之间的相关性分析,一方面提示血清心肌损伤标志物及炎性因子的变化可间接反映心肌的SOX9受损情况;另一方面进一步佐证了SOX9与急性心肌的缺血损害有关。

综上所述,AMI时心肌缺血可导致SOX9表达量下降,其改变可能与心肌的损害程度有关;24 h内血清hs-cTn、CK-MB、Mb心肌损伤标志物与IL-6、TNF-α炎性因子的变化可以反映AMI时SOX9蛋白下降及心肌损害情况。