嵌合抗原受体T细胞的设计、制备及挑战

张 雷,徐 林,胡 威

(1.遵义医科大学第二附属医院 胸部肿瘤科,贵州 遵义 563006;2．遵义医科大学 免疫学教研室,贵州 遵义 563099)

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)免疫疗法是通过基因工程等手段修饰T淋巴细胞,使其能够识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR),从而特异性识别并杀伤肿瘤细胞的一种过继细胞疗法(adoptive cell therapy,ACT),被广泛应用于肿瘤靶向细胞治疗的研究。CAR-T是近年来癌症免疫治疗领域的重大突破之一,其在血液恶性肿瘤中的临床成功正推动着日益复杂的免疫细胞疗法的发展,并可能在未来几年应用于实体瘤和非恶性疾病的治疗［1]。

目前,CAR-T疗法已经经历了四代技术革新,每一代的结构创新都使其更安全和高效。大量研究显示,CAR蛋白的活性因整体结构设计而有所不同,信号结构域的选择,也会显著影响治疗的结果,新的CAR-T的设计理念和方法仍在不断探索中,但尚没有标准的模式［2]。本文介绍了CAR的结构演变及CAR-T细胞治疗的临床前研究常用的设计和制备方法,并阐述当前该领域所面临的挑战,以期为CAR-T细胞治疗的基础研究及临床应用提供有价值的参考。

1 CAR-T的结构组成及更新换代

1.1 CAR-T的结构组成 CAR是一种人工设计合成的抗原受体分子,它可以赋予T细胞针对靶抗原的特异性特征,从而增强T细胞识别靶抗原信号和活化的功能。CAR的结构主要分为胞外结构域、跨膜结构域以及胞内结构域［3]。当CAR的抗原识别结构域与其靶抗原结合时,整个蛋白质都会发生构象变化,从而改变了胞内某些氨基酸的暴露和反应性,导致几种翻译后修饰的催化,启动细胞内信号级联,最终导致T细胞激活,然后释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞或诱导细胞因子分泌、T细胞增殖等。

胞外结构域主要由抗原识别结构域和铰链区组成。抗原识别结构域是CAR-T最重要的结构,最常采用的是单链可变片段(single-chain fragment variable,scFv),由抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过连接肽连接而成,是抗体活性的最小功能结构单位,CAR-T通过scFv特异性地识别肿瘤相关抗原,CAR-T细胞的肿瘤靶向性往往由scFv决定。

铰链区大多是柔性链的结构,该区域主要负责调节scFv与靶抗原表位之间的生物物理相互作用,铰链区的长度决定了T细胞和肿瘤细胞之间的距离,适宜的长度赋予scFv灵活性,可以影响scFv功能的发挥以及T细胞的活化增殖,有助于提高疗效［4]。现在使用的铰链区主要有IgG1分子、IgG4分子、IgD分子、CD8分子和CD28分子的铰链区。

跨膜结构域的功能包括将CAR锚定在细胞膜上,将CAR的胞外结构域和细胞内结构域连接,起到稳定整个嵌合抗原受体蛋白的作用,同时能够有效地传递跨膜信号,是将配体识别信号转导到胞内结构域的桥梁。通常所使用的跨膜结构域与铰链区或胞内的共刺激结构域是重合的,CD8α分子、CD28分子或ICOS分子的跨膜区在CAR中较常见。

CAR的胞内结构域在启动配体识别触发的细胞内信号级联过程中起着至关重要的作用。胞内结构域由共刺激结构域(costimulatory domain)(或共刺激分子)和信号转导结构域(signaling domain)组成。共刺激结构域在产生T细胞活化的第二信号中起关键作用,第二信号还可增强第一信号的作用,双重信号的共同刺激可使T细胞完全活化,有效地延长存活,维持增殖,并促进细胞因子释放。已知的T细胞共刺激分子包括CD28、4-1BB、ICOS、CD134分子等。目前运用最多的是CD28和4-1BB分子。

信号转导结构域主要是T细胞受体TCR/CD3的ζ链,CD3ζ链是一个具有诱导酪氨酸激酶功能的结构域,它包含3个免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAMs),是磷酸化位点,它能募集一种蛋白激酶ZAP70,双重磷酸化ITAM,导致信号级联的激活。CD3ζ链被认为是所有CAR结构中必须包括的一个内部结构域。在T细胞中,ITAM的数量和多样性以及功能性CD3ζ对于优化信号传导至关重要［5-8]。

1.2 CAR-T的迭代更新 人们现阶段主要根据CAR不同的细胞内信号转导结构将CAR分为4代。第一代CAR的胞内区只采用CD3ζ链,TCR与CD3分子构成复合物后通过CD3ζ链传递激活T细胞的第一信号,只有基本的识别靶抗原和激活T细胞的功能。T细胞存活时间短,增殖能力低,对肿瘤细胞无杀伤功能或杀伤功能较弱,所以第一代CAR-T的临床结果并不理想［9],并未引起人们的重视。

随着对T细胞活化过程的进一步研究,研究人员发现共刺激分子提供的第二信号对于T细胞的活化至关重要。因此,第二代的CAR-T使用了一个共刺激分子,目前在临床上,只有CD28和4-1BB用于商业上第二代CAR-T细胞产品。大规模临床试验结果表明,表达CD28和4-1BB的CAR-T具有相似的抗癌活性,同时两者的功能和毒副效应具有差异性。通常表达CD28共刺激结构域的CAR驱动更强大的T细胞扩增,促进效应谱系细胞分化,显著提升T细胞的杀伤效果,但持久性低［10]。而表达4-1BB的CAR-T与靶抗原结合后分裂速度较慢,更多表现为记忆表型,降低CAR-T细胞的耗竭率,提高其在体内的存活时间［11-13]。随着第二代靶向CD19的CAR-T细胞的改进以及国际临床试验的成功进行,2017年FDA批准了首款CAR-T细胞疗法产品上市［14]。目前全球已经上市7款CAR-T细胞产品,均为第二代CAR-T细胞［15]。

第三代CAR-T包含了两种不同的共刺激分子,目的是进一步提高T细胞在体内的存续性和细胞毒性［16]。根据实验,第三代CAR-T相比于第二代展现出更强的细胞因子释放、更长的持续时间以及更好的肿瘤根除能力［17]。然而,第三代CAR-T相对于第二代CAR-T的优势目前仍然是一个充满争议的话题［18],其引起的细胞因子释放综合征(CRS)等安全性问题的发生率明显增加,这可能归因于两个共刺激域的重复信号传递,目前第三代CAR-T在临床上仍未普及［19]。具有CD28和4-1BB共刺激分子的CAR-T细胞是最常用的第三代CAR-T细胞。其他共刺激分子如OX-40和ICOS也用于各种研究中,不同共刺激结构域可以诱导T细胞分化或产生细胞因子,同时共刺激结构域的顺序不同也可以使CAR-T细胞的功能产生差异,从而影响其抗肿瘤效应［20]。

第四代CAR-T又称通用细胞因子介导杀伤的重定向T细胞(T cell redirected for universal cytokine-mediated killing, TRUCKs),在二/三代的基础上整合结构性或诱导性转基因信号,例如细胞因子和趋化因子的信号,从而使其具有促进T细胞增殖、提升T细胞效应能力、趋化效应细胞至靶细胞周围的能力,如细胞因子IL-7、IL-12、趋化因子CCL19等;或者加入自杀基因,在出现不良反应时可诱导CAR-T细胞自我毁灭。改进后的四代CAR-T,能够招募和活化更多的免疫细胞,抵抗肿瘤微环境,扩大局部肿瘤杀伤效果［21- 22]。目前,第四代CAR-T的功能和疗效仍在进一步探索中,其设计也在不断完善,诸多问题尚待解决。

1.3 新一代CAR-T 通用型CAR-T细胞(universal chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,UCAR-T),是将特异性的CAR引入健康人同种异体T细胞中的技术,即经过基因编辑的同种异体CAR-T细胞,属于“现货型”或“off-the-shelf”产品。该技术可使用siRNAs来沉默供体细胞中MHC-I、MHC-II、TCR和免疫检查点分子的表达,这种沉默使它们不易于被宿主的免疫系统识别,从而降低并减少了引起移植物抗宿主病(graft-versus-host-disease,GVHD)和宿主抗移植物反应(host-versus-graft-reaction,HVGR)等免疫排斥反应的风险,提高UCAR-T细胞在受体体内的存活能力,缓解免疫抑制对T细胞的耗损,提高UCAR-T细胞的功能［23]。UCAR-T细胞的研究,一方面解决了自体CAR-T细胞的T细胞取材过程复杂、制备时间较长、成本高的弊端;另一方面还可抑制T细胞耗尽、减少CAR-T细胞的靶毒性,进而提高CAR-T细胞的活性水平和毒性［24],有望形成下一代CAR-T技术,给癌症治疗领域带来了全新的诊治思维与前景。

另外,随着CAR-T细胞疗法取得了革命性的成功,科学家对基于CAR细胞治疗的其他效应细胞展开了大量研究,自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)和巨噬细胞(macrophages,Mφ)由于良好的性能,成为制造下一代CAR细胞的两个候选细胞。与T细胞不同的是,它们是固有免疫系统的成员,可以在没有MHC的情况下直接识别靶细胞,也不会引起GVHD。嵌合抗原受体NK细胞(chimeric antigen receptor natural killer cells,CAR-NK)具有来源广泛、制备时间短、安全性可靠、应用范围广泛、毒副风险低等优点;而嵌合抗原受体巨噬细胞(chimeric antigen receptor macrophages,CAR-M)则比CAR-T和CAR-NK在免疫抑制性微环境中更容易浸润肿瘤,进而调控肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)的比例和表型,扭转抑制性肿瘤微环境,创造促炎环境,发挥积极抗肿瘤作用。随着研究的继续深入,CAR-NK与CAR-M可能会成为CAR-T的补充和替代疗法,并有望成为治疗实体瘤的一种有效策略［25-27]。

2 CAR-T的制备方法

临床上自体CAR-T细胞的生产是通过多种方法进行的,这些方法都包含相同的常规步骤:从患者身上分离外周血单个核细胞(PBMCs),从PBMCs中分离出T淋巴细胞,利用质粒转染、病毒载体等方法将CAR基因导入T细胞中形成CAR-T细胞,再通过体外扩增CAR-T细胞到治疗所需的细胞数量,再重新注入患者体内进行治疗。临床前研究中的制备过程也大致相同。常规CAR-T疗法开发流程包括靶标抗原的选择和鉴定、CAR结构的设计与合成、CAR基因的转导、CAR-T细胞的扩增和培养。尽管在目前的试验中,该过程的总体轮廓是相似的,但在制造CAR-T细胞产品的过程中,仍有各种各样的选择,该过程远未标准化,通常需要大量的人工处理步骤［28]。

2.1 筛选靶抗原与单链抗体scFv的产生 ①抗原筛选:首先需要选择与目标疾病相关的靶标抗原(通常是肿瘤相关抗原TAA),并对该抗原在正常组织中的表达情况进行评估,从而筛选出特异性强而毒副作用弱的靶标抗原。②获得特异性高的抗体:可通过单克隆抗体开发或从文库中筛选已知的抗体,选择特异性高、稳定性好、亲和力适当的抗体作为CAR的抗原识别部分。③对获得的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)基序列进行测序分析。④分离纯化T细胞,对其进行测序,找到T细胞内负责活化受体的区域序列。

2.2 CAR的结构设计和合成 通过基因工程技术将识别TAA的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)基因序列与铰链区/跨膜域、TCR/CD3ζ和CD28或4-1BB共刺激结构域的受体基因序列在体外进行重组,形成完整的CAR基因。此外,如前所述CAR分子结构的每一个部分都相对独立并协同影响CAR-T细胞的功能,对其活化、持久性、抗肿瘤作用及毒副作用至关重要,因此还需考虑CAR信号传递和激活的机制等因素,对其结构进行优化,如跨膜结构域和铰链结构域的差别,会影响CAR的表达从而影响CAR-T功能发挥,进而影响实验结果,研究表明精心设计CAR的结构以及选择驱动CAR基因表达的启动子可以改善CAR的表达［29]。一般以scFv和共刺激分子为切入点,根据靶向的抗原的不同设计和优化CAR分子。除了对“经典”CAR结构进行修饰以外,研究还探索了新型的设计策略,如多抗原靶向(针对抗原逃逸的双价串联CAR)、门控逻辑:“AND”门与“NOT”门(能特异性识别正常组织的CAR),携带自杀基因的CAR等。CAR分子的设计包含了多个模块,其胞内和胞外结构域的优化设计一直在研究中［30]。

2.3CAR基因的转导 合成CAR基因后,最关键的一步是通过体内或体外的方式将mRNA传递并整合到T细胞中,使T细胞表达CAR。CAR基因的转导方式可分为病毒方式和非病毒方式,包括转座子/转座酶系统、体外转录的mRNA和病毒载体等。病毒载体是最常用的基因转导方法,慢病毒载体(lentiviral vectors, LV)在其中占主导地位,而逆转录病毒载体(gamma retroviral vectors, GRV)是第二常用的方法。这两种方法都可以产生安全有效的产品,且转导效率高。两种载体的主要区别在于GRV载体只能感染分裂细胞,而LV载体还可以感染静止细胞［31],具有能稳定表达外源基因、感染谱广泛等优点。LV载体通常通过使用大量质粒DNA(pDNA)进行瞬时转染而产生,所以LV载体比使用稳定包装细胞系生产的GRV载体更昂贵。病毒载体的处理过程始于生产细胞系的扩增,例如HEK293T细胞。通过分子克隆的方式将目的基因连接到慢病毒表达载体质粒中,构建重组慢病毒表达载体,然后将携带目的基因的质粒转染生产细胞系,以转移制备病毒颗粒所需的基因。转染后,从细胞上清中收获产生的病毒颗粒,通过离心浓缩获得高滴度的慢病毒。通常使用抗CD3/CD28抗体结合珠活化T细胞,激活后与浓缩的慢病毒颗粒共培养,CAR治疗基因通过病毒转染被整合到靶T细胞基因组中,实现外源基因的持续稳定表达,以产生功能齐全的CAR-T细胞,然后再培养扩增CAR-T细胞。

3 CAR-T细胞面临的挑战

3.1 CAR-T细胞制造中的问题 CAR-T细胞的体外生产流程是一个复杂且受到严格控制的过程。首先,CAR-T细胞产品作为“活的、自体的”生物药品,其生产方式的安全性、稳定性、质量控制、个体差异性等方面需要特殊考量,目前CAR-T细胞的生产技术尚未标准化和自动化,仍在一步步地探索中。其次,该生产全过程无菌要求高,一般的制备流程需2～4周,制造周期长往往难以使患者得到及时治疗［32]。优化CAR-T细胞制造过程的一个重要途径是缩短制造时间。陆军军医大学研究的Fast CAR-T(F-CAR-T)次日制造平台显著缩短了CAR-T的制备时间,最近在B细胞ALL的临床试验中进行了评估(NCT03825718),与传统的CAR-T细胞相比,CD19 F-CAR-T细胞在临床前研究中表现出良好的增殖性,细胞表型更年轻,消耗更少,肿瘤清除更有效,显著减少制造时间和成本［33]。

在CAR-T制造中,CAR基因传递目前最常用的是病毒载体系统,但鉴于病毒载体的基因传递方法复杂且昂贵,并且存在插入诱变的风险,开发基因传递的无病毒平台是优化CAR-T细胞制造过程的另一个重要途径。转座子/转座酶是基因治疗领域较新的表达系统,这是一种非病毒的、基于质粒的基因传递方法,该方法具有高效安全,毒副作用低的特点,备受研究者青睐［34]。如睡美人(sleeping beauty,SB)转座子系统和piggyBac(PB)转座子［35-36],SB转座子系统已被用于生产Ⅰ/Ⅱ期临床试验的CAR-T细胞［37-38]。与使用逆转录病毒或慢病毒载体相比,基于转座子/转座酶的基因传递可以携带更大的遗传结构,同时能整合靶基因,且具有显著的经济优势。

基因编辑技术是一种很有前途的新方法,不仅适用于产生基因工程的自体CAR-T细胞,也适用于“现货型”同种异体CAT-T细胞,这可能解决自体T细胞疗法固有的制造挑战和成本过高的问题。CRISPR-Cas9是当前使用最为广泛的基因编辑技术,已被用于癌症患者产生和临床应用具有可耐受不良事件的CAR-T细胞［39-40]。CRISPR-Cas9可通过敲除免疫检查点分子或其他抑制性调节因子等,改善体内CAR-T细胞的存续性。如定向删除CBL-B(一种免疫激活的负调节因子)显示可恢复T细胞耗竭并增强IFN-g和TNF-a水平以及CAR-T细胞的细胞毒性［41]。在CAR-T的生产制造中,对CRISPR-Cas9进行更全面的研究,以提高CAR-T细胞疗法的安全性、有效性和可及性,可能会在临床上带来理想的治疗结果［42-43]。

“体内构建”/“体内重编程”的体内CAR-T制备是另一种新兴方法,与体外生成CAR-T相比可以节省时间、提高可及性和降低制造成本。在这种方法中,编码CAR的体内递送载体:病毒载体［44-45]或纳米颗粒载体［46-47]能够特异性识别并结合患者的T细胞,进行CAR基因转导或进行基因组整合实现体内细胞的重编程,从而在体内生成CAR-T细胞并清除肿瘤细胞［48],由于该CAR-T细胞是在体内生成的,故在一定程度上可以避免移植物与宿主的反应,该方法不仅操作相对简单,而且还可以规避制造耗时长和成本过高等问题。

3.2 毒副作用和不良反应 CAR-T细胞治疗后观察到的最常见毒副作用或不良反应是细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome,ICANS)和肿瘤溶解综合征(tumor lysis syndrome,TLS)等,且其发生机制均不完全清楚。毒副作用的限制是目前CAR-T广泛使用以及影响其疗效的重要因素之一,也是目前急需攻克的难题,并且随着接受CAR-T治疗以及随访的病例数增多,逐渐观察到长期毒副作用,如持续性B细胞耗竭或发育不全、低丙种球蛋白血症、白细胞减少症和感染、脑水肿等,但值得注意的是,其长期毒性作用小或有限,所以我们对CAR-T疗法依然持乐观态度［49-50]。

目前对CAR-T的不良反应的应对措施主要包括对症支持治疗和免疫抑制剂等。继续优化CAR的结构或与其他治疗方法联合等方法的进一步研究,以降低不良反应的影响,提高CAR-T治疗效果,才能使更多患者受益。

3.3 实体瘤适用性不佳 CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了显著的成果,但对于占所有癌症90%的实体瘤而言,其治疗效果有限,到目前为止临床尚无获批产品。其次,即使找到特异性的肿瘤抗原,CAR-T细胞也可能受限于肿瘤低表达趋化因子,而导致T细胞定向运输和浸润不足。另一个重要的挑战是肿瘤免疫抑制性微环境TME,TME中存在着多种免疫抑制性细胞和细胞因子,能促进肿瘤生长并限制CAR-T功能,也会因肿瘤抗原丢失而削弱特异性识别［51-53]。

鉴于以上障碍和局限性,科学家不断尝试新的方法并展开了大量研究,如进一步优化改进CAR的结构或开发其他效应细胞。如Meyran等［54]开发了一种生成功能性干细胞样CAR-T细胞(TSTEM-likeCAR-T cells)的方案,具有增强增殖潜能、体内持久性和肿瘤控制能力的特点,CAR-T细胞接受抗原刺激后增殖能力增强且细胞因子分泌增加,其过继转移能加强肿瘤的控制和对临床前模型中肿瘤再攻击的抵抗,结合抗PD-1治疗可以根除已形成的肿瘤。Tousley等［55]将布尔逻辑门控应用于CAR-T细胞,设计了逻辑门控细胞网络(LINK)CAR,能有效区分正常组织与癌变组织,使得CAR-T技术更有效根治实体瘤,同时防治脱靶和肿瘤外毒性。

4 CAR-T细胞的改进策略

适当的CAR组成和结构设计可以减少脱靶效应,增强肿瘤的根除和持久性,然而,虽然人们认识到这些CARs结构和特征的微小变化可能是关键的功能决定因素,但这些因素之间的关系很复杂,目前还没有通用的设计规则可以预测其在体内的功能。

4.1 改善CAR-T细胞抗原识别 除了对“经典”CAR结构部件进行修饰之外,许多研究还探索了其他的设计策略［56]。含有逻辑门控的下一代CAR可以通过组合抗原,优化识别能力,更好的区分肿瘤组织和健康组织,同时提高抗原覆盖率克服抗原逃逸。如双特异性CAR-T细胞靶向两种不同的TAA,具有优越的抗原识别能力,可以同时靶向两个或多个不同的细胞群,当一种抗原丢失时,肿瘤的杀伤能力仍然可以保持［57]。Larson等［58]使用初始/记忆性T细胞(naïve/memory T cells TN/MEM)表达双特异性抗CD19/CD20在治疗复发或难治性非霍奇金淋巴瘤(NCT04007029)的Ⅰ期试验中展现出极富前景的应用价值,该双特异性CAR-T具有稳定的安全性和耐受性,可能是增强抗原识别能力、改善CAR-T细胞持久性和克服抗原逃逸的有效策略。为了提高CAR-T的敏感性和抗肿瘤能力,CAR的模式不断从单靶点、双靶点向多靶点过渡,但由于肿瘤相关抗原数量有限,而肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen,TSA)极为稀缺,寻找在肿瘤细胞上稳定表达的特异性新抗原是目前CAR-T疗法中的研究热点［59],目前靶向EB病毒潜伏膜蛋白(epstein-barr virus latent membrane protein 1,LMP1)、黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene,MAGE)、死亡受体5(death receptor 5,DR5)等各种新靶点CAR-T临床试验也在进行中［60]。然而,这种方法目前受到肿瘤抗原数量限制,但随着测序技术的发展,未来将发现更多的肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原,从而使更多患者受益。

4.2 增强CAR-T细胞的持久性 由于肿瘤微环境中过多的抑制性因素可以负面影响CAR-T的存活、浸润和活性,从而导致CAR-T细胞功能减退和过早耗竭,因此提高CAR-T细胞的持久性仍然是一个巨大的挑战。到目前为止,许多研究已经取得了明显的突破。如第四代CAR-T增强的细胞因子分泌和表达能力可抵抗或消除TME中的免疫抑制环境,克服T细胞耗竭。另外通过基因编辑工具CRISPR-Cas9对同种异体CAR-T细胞(也称异基因allo CAR-T)进行操作,在一定程度上可实现CAR-T细胞功能的增强。Hu等［61]利用CRISPR-Cas9编辑生成人类低免疫(HIP)T细胞,并在此基础上制备HIP CAR-T细胞,结果显示HIP CAR-T细胞在肿瘤清除的持久性以及CAR-T细胞扩增和持久性方面明显优于未修饰的allo CAR-T细胞。

4.3 增加CAR-T细胞向肿瘤部位的定向迁移 在癌症中,趋化因子及其受体对免疫细胞的迁移及浸润具有重要作用,如在肿瘤微环境中,肿瘤细胞上高表达趋化因子受体的配体,在调节免疫细胞迁移到肿瘤中的模式起着关键作用,形成肿瘤微环境的免疫特征,通常朝向促肿瘤形成状态。癌症趋化因子信号转导是一种新技术,可提高肿瘤部位免疫细胞的募集率,由于其趋化特性,它们能够调节多种免疫细胞和体细胞的迁移和运输。趋化因子受体如CXCR1［62]、CXCR2［63]、CXCR6［64]等在CAR-T细胞中的表达,具有增强T细胞活化和肿瘤浸润效果,使肿瘤消退、延长生存期。

5 展望

CAR-T细胞疗法应用前景十分广阔,但目前仍存在诸多障碍,如CAR-T的生产效率低、耗费高、存在严重的毒副反应、在实体瘤方面应用不佳等问题。但随着CAR-T细胞生产技术的不断完善和成熟,新型CAR的开发和下一代CAR的探索,都可能克服目前的局限性和障碍,从而进一步拓宽CAR-T细胞疗法的应用范围,推动这一疗法朝着新的领域和重大的突破前进,使其安全、有效、广泛应用于人体肿瘤或非肿瘤等疾病的治疗中,以便更多的患者能够获益。