基于熵权法结合重复正交试验优选祛疤止痒洗剂提取工艺研究 *

牛江进 熊 丹 袁 淼 蔡小霞 蔺 涛 蒋翠平 陶叶琴 谢宗明

（浏阳市中医医院制剂科，湖南 浏阳 410300）

增生性瘢痕［1］是指皮肤受创后纤维结缔组织过度增生所导致的一种病理性瘢痕，易引起瘙痒疼痛。若处于关节部位会导致运动障碍，甚至其对外貌的损害极易导致严重的心理问题。因此，对瘢痕的治疗具有生理和心理双重意义［2］。西医认为伤口边缘张力是造成瘢痕增生的主要因素，目前临床上常应用A 型肉毒毒素抑制瘢痕增生［3-5］。而中医认为其病机为皮肤受创，正气虚弱，邪毒外入，壅滞气血，邪毒与体内浊气、瘀血、痰湿搏结于创伤愈合之处而成。因此中医在治疗增生性瘢痕时，多从活血化瘀、通络止痛、化瘀散结等治则入手，内服外治相结合应用［6］。

祛疤止痒洗剂（QBL）为浏阳市中医医院烧伤整形美容科医生10 多年的临床经验总结，由野菊花、苦参、三棱等11味中药组成，具有祛风止痒、清热解毒、化痕消瘢的功效，可用于增生性瘢痕及瘢痕瘙痒。中药提取工艺研究中，多指标的综合评价是提取工艺参数优选的关键步骤［7-11］。本试验中选择水提工艺，并以干膏得率及蒙花苷［12］含量为考查指标，并采用熵权法［13-17］对正交试验结果进行综合评价，确定QBL 的最佳提取工艺参数，旨在为QBL的备案申请提供真实可靠的数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器电子天平（上海浦春计量仪器有限公司，JY-202）；电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司，HWS-26）；SXKW数显控温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）；RE5205旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司，DHG-9240A）；电子天平（德国赛多利斯，BSA224S-CW）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ2200）；低速离心机（长沙鑫奥仪器仪表有限公司，GENIUS 4K）；高效液相色谱仪（日本岛津，LC-10AT）；隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司，GM-0.33A）。

1.2 试药野菊花、苦参、龙胆、地肤子、土茯苓、生地黄、麸炒苍术、五倍子、三棱、莪术、荆芥11味药材均购自湖南省淳芝宝药业有限责任公司，经浏阳市中医医院主任药师谢宗明鉴定，均为《中华人民共和国药典》2020年版（一部）［12］收载品种；蒙花苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111528-201212），QBL溶液（自制），色谱甲醇（德国默克股份有限公司，型号：1.06007.4008）。

2 方法与结果

2.1 蒙花苷含量测定

2.1.1 对照品溶液配制精密称取蒙花苷对照品（含量98.0%）0.0081 g，加色谱甲醇超声溶解，定容至100 mL，制成质量浓度为81 μg·mL-1的对照品母液。分别精密量取对照品母液1、2、4、6、8 mL 置于10 mL 容量瓶中，加色谱甲醇定容至10 mL。得蒙花苷质量浓度分别为8.1、16.2、32.4、48.6、64.8 μg·mL-1的系列对照品溶液。

2.1.2 QBL供试品溶液制备按QBL处方称取饮片，按正交试验各水平组合条件进行提取，合并各次提取液，减压浓缩（65 ℃，-0.09 MPa），定容至250 mL，量取提取液10 mL，4000 r/min，离心半径为123 mm，离心10 min，上清液过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液制备按QBL 处方称取除野菊花外各味饮片，按正交试验1 号水平组合提取，制备方法参考2.1.2项。

2.1.4 色谱条件Inertsil ODS-3C 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（26∶23∶1）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：334 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL，理论塔板数按蒙花苷峰计算应不低于3000［12］。

2.1.5 方法专属性考察分别精密吸取蒙花苷对照品溶液、QBL 供试品溶液、阴性样品溶液，按2.1.4项下色谱条件进样检测分析。见图1。

图1 蒙花苷专属性考察高效液相色谱图

2.1.6 对照品溶液线性关系考察分别精确吸取系列浓度的对照品溶液各20 μL，按2.1.4 项下色谱条件进样检测分析。以对照品浓度（x，μg·mL-1）作为横坐标，蒙花苷峰面积（y）作为纵坐标绘制标准曲线，计算其线性回归方程y=37325x+101009，r=0.9995。结果表明蒙花苷浓度在8.1～81 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.7 精密度试验精密量取质量浓度为48.6 μg·mL-1的对照品溶液20 μL，按2.1.4 项下色谱条件连续进样检测6 次，记录蒙花苷峰面积，其RSD 为1.27%，表明仪器和方法的精密度良好。

2.1.8 重复性试验按正交试验1号水平组合条件提取，按2.1.2方法制备6份QBL供试品溶液，按2.1.4项下色谱条件进样检测，记录蒙花苷的峰面积，计算蒙花苷含量，其RSD为2.94%。表明该方法具有良好的重复性。

2.1.9 稳定性试验按正交试验3号水平组合条件提取，按2.1.2 方法制备QBL 供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h 时按2.1.4 项下色谱条件进样检测，记录蒙花苷峰面积，计算蒙花苷含量，其RSD 为2.27%。表明供试品12 h内较稳定，能够满足检测需求。

2.1.10 加样回收率试验 精密量取已知含量的供试品溶液2 mL（n=6），分别精确加入2 mL 蒙花苷对照品溶液并定容至10 mL，按照色谱条件测定，计算蒙花苷回收率和RSD。结果蒙花苷平均回收率为100.27%，RSD 为1.57%。表明该测定方法准确可靠，可用于样品蒙花苷含量测定［13］。

2.1.11 样品含量测定 取2.1.3 项下27 批水提液，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.4项下色谱条件测定，采用外标一点法进行计算，得各次试验提取液中蒙花苷含量。

2.2 干膏得率测定测定方法［12］：精密量取已定容的提取液25 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥6 h，置干燥器中冷却0.5 h，迅速精密称定，至2 次重量差异不超过0.3 mg 为止，记录各样品液的干膏重量，按公式1 计算干膏得率。试验结果见表1。

表1 正交试验水平组合及试验结果

注：W 为干浸膏重（g）；W1为药材取样量（g）；V为定容体积（mL）。

2.3 提取工艺研究

2.3.1 正交试验设计按处方配比称取苦参、野菊花、三棱、莪术、荆芥、麸炒苍术、土茯苓、地肤子、龙胆、生地黄、五倍子11 味饮片共102 g。以提取次数（A）、提取时间（B）、液料比（C）、浸泡时间（D）为考察因素，设计3 个不同水平，按照L9（34）正交表进行正交组合，每个水平组合重复3次试验［18］。因素及水平见表2，正交试验水平组合及试验结果见表1。

表2 正交试验因素水平表

2.3.2 正交试验结果按2.1.11项下方法进行样品测定，得提取液中蒙花苷含量，按2.2 项下测定，得各样品液干膏得率。见表1。

2.3.3 熵权法客观赋权熵权法是根据各项指标值的变异程度来确定指标权重的客观赋权法，其指标的变异程度越小，其对应的权值越低。计算的具体步骤按王继龙等［16］所用方法。见表3。

表3 各指标熵值及权重

2.3.4 综合评价考察指标综合评分计算公式：

按公式2计算综合评分，采用Excel对综合评分结果进行直观分析和方差分析［19］，以P＜0.05 为差异有统计学意义。结果见表4、表5。

表4 综合评分计算结果及直观分析表

表5 方差分析表

结果表明A、B、D 因素差异均极显著（F＞F（0.01）），C 因素差异显著（F（0.05）＜F＜F（0.01）），差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。极差A＞B＞D＞C（R=9.4241＞7.1307＞2.2140＞1.4689），即提取次数对综合评分的影响最大，影响最小的是料液比。A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C3＞C2＞C1、D1＞D3＞D2，综合生产实际情况，选择最佳提取工艺为A3B3C3D1，即加水回流提取3次，第1 次加12 倍量水，浸泡0.5 h，加热回流2 h；第2次加10 倍量水，加热回流1.5 h；第3 次加8 倍量水，加热回流1 h。

2.4 工艺参数验证为考察祛疤止痒洗剂优选提取工艺的可靠性和稳定性，按照优选方案提取并重复3次试验。结果表明出膏率的RSD 值为3.01%，蒙花苷含量的RSD值为3.78%，工艺稳定可行，符合预期设计。

3 讨论

中药复方成分复杂，以单一成分为指标无法体现中药多组分、多靶点的特点，因此，多指标评价体系已成为现行中药提取工艺研究的主流方法，本研究前期拟选择君药苦参、野菊花特征成分及干膏得率为评价指标，但在预实验过程中发现苦参特征成分苦参碱、氧化苦参碱含量测定时阴性对照存在干扰，方法专属性较差，故只选择蒙花苷及干膏得率为评价指标。

在多指标综合评价过程中，指标的权重分配对评价结果影响较大。常用权重计算方法有层次分析法（AHP）和熵权法、标准离差法、CRITIC 法等。本研究采用了精度较高，客观性较强的熵权法来计算指标权重，避免了主观确定权重的随意性，具有直观性好、灵活方便等特点，且数学模型计算相对简单，使用Excel 即可完成熵权计算，简便易操作。

正交试验是提取工艺优化时常用的设计方法，可以最少的试验次数达到与大量全面试验等效的结果，是一种高效、快速而经济的多因素试验设计方法。但中药复方提取过程中偶然因素较多，单次试验结果不确定性较高，而本研究通过重复试验，有效减小了误差，优选的提取工艺参数可靠性更高。对优选的参数进行3次验证，结果表明优选的工艺简便可行，质量稳定，为QBL 的大批量生产提供了有效的数据支撑。