黄秋葵-火龙果酵素工艺优化及特性分析

赵 飞，孙 莉，刘雪梅，王晓敏，曲春婷，程延玲，王裴沛，孙传荣，刘亚琦，张培欣，张晨昊，侯雨婷，李心茹

（1.潍坊科技学院贾思勰农学院，山东 潍坊 262700；2.山东省设施园艺生物工程研究中心，山东 潍坊 262700；3.中华全国供销合作总社济南果品研究所，山东 济南 250220）

食用植物酵素含有多种生物活性物质，具有抗衰老、抗氧化、解酒护肝及提高机体免疫力等功效[1-4]。在酵素制备过程中起关键作用的是微生物，通过利用微生物的发酵作用将原料所含的物质进行转化，将生成的分解代谢产物释放于酵素中，使其含有丰富的风味成分；发酵微生物大多为益生菌，在发酵过程中产生有益的生物活性物质，从而使酵素具有一定的功能特性[5]。蒋增良等[6]研究了在天然条件下发酵葡萄酵素的体外抗氧化能力的变化，在发酵过程中其抗氧化性能总体呈现上升趋势；蔡丽琴[7]研究表明发酵10～20 d 的混菌发酵猕猴桃酵素具有最佳的抗氧化能力。夏国灯等[8]以玫瑰花作为原料，采用复合乳酸菌发酵，优化其发酵工艺，结果表明玫瑰酵素液发酵后的抗氧化能力较强。洪厚胜等[9]以葡萄渣和糖蜜等为发酵原料，优化接种酵母菌、乳酸菌和醋酸菌发酵的酵素工艺，制作出有机酸丰富、香气成分突出和色泽鲜亮、口感、风味具佳的酵素产品。利用接种发酵制备果蔬酵素，研究其发酵过程中代谢产物的变化规律，从而优化产品品质，并为发酵生产提供了技术指导和理论支持。

黄秋葵（Okra Hibiscus esculentusL.）又名咖啡黄葵、秋葵、洋角豆，是锦葵科秋葵属（Malvaceae genera）一年生食药两用的草本植物，是具有较高营养价值和药用价值的新型保健蔬菜[10]，起源于非洲和亚洲等热带地区，目前在我国南方和北方地区均有种植[11]。黄秋葵含有果胶、多糖、蛋白质、可溶性膳食纤维、维生素和微量元素等营养物质[10-13]。但黄秋葵蒴果成熟期短，肉质易老化、纤维化，食用价值降低，需及时采收并进行深加工。目前黄秋葵主要被加工为冻干果干、冻干果粉、复合果蔬汁和保健袋泡茶等初级产品[10]，而对黄秋葵酵素方面研究较少。因此，本研究以黄秋葵为原料，采用接种乳酸菌的发酵技术，优化黄秋葵酵素的发酵工艺，测定酵素的总酸、pH值、可溶性固形物含量、色深和色调、色差、羟基自由基清除能力等，以期为实现黄秋葵酵素的工业化生产、综合性开发以及品质的提升提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄秋葵，购自山东潍坊寿光；柠檬，四川安岳；红心火龙果，市售。乳酸菌，5 菌型：保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌，北京川秀科技有限公司；冰糖，市售。

酚酞，西陇科学股份有限公司；乙醇，天津富宇精细化工有限公司；水杨酸，天津永大化学试剂有限公司；过氧化氢、氢氧化钠，烟台市双双化工有限公司；硫酸亚铁，天津恒兴试剂制造有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

二列八孔电热恒温水浴锅，龙口市先科股份有限公司；C21-WT2112T 电磁炉，美的生活电器制造有限公司；YP502N 电子天平，上海精密科学仪器公司；T6 新悦-可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；CS-410 分光色差仪，杭州彩谱科技公司；TD-45 数显糖度仪，浙江托普云农科技公司；FE28 pH 计，梅特勒-托利多仪器公司；SJ-CJ-2FDQ 超净工作台，江苏苏洁净化设备厂。

1.3 方法

1.3.1 黄秋葵酵素制备

挑选新鲜无损坏的黄秋葵、火龙果和柠檬，用无菌水洗净、晾干、切块后放入已灭菌的发酵罐中，添加灭菌冰糖，加入乳酸菌菌液（将乳酸菌菌粉溶于无菌水中，配置不同浓度菌粉液），进行避光静态发酵[14]，以上所有操作均在无菌室中进行。

1.3.2 单因素试验

（1）不同黄秋葵、火龙果添加比例对酵素品质的影响

控制冰糖添加量140 g/L，菌粉添加量0.75 g/L，发酵温度35 ℃，发酵时间72 h，分别改变黄秋葵和火龙果的添加比例3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。发酵结束后对发酵液进行感官评价，确定最佳的黄秋葵和火龙果添加比例。

（2）不同发酵时间对酵素品质的影响

控制黄秋葵和火龙果的添加比例1∶1，冰糖添加量140 g/L，菌粉添加量0.75 g/L，发酵温度35 ℃，分别改变发酵时间24、36、48、60、72 h。发酵结束后对发酵液进行感官评价，确定最佳的发酵时间。

（3）不同发酵温度对酵素品质的影响

控制黄秋葵和火龙果的添加比例1∶1，冰糖添加量140 g/L，菌粉添加量0.75 g/L，发酵时间72 h，分别改变发酵温度25、30、35、40、45 ℃。发酵结束后对发酵液进行感官评价，确定最佳的发酵温度。

（4）不同菌粉添加量对酵素品质的影响

控制黄秋葵和火龙果的添加比例1∶1，冰糖添加量140 g/L，发酵温度35 ℃，发酵时间72 h，分别改变菌粉添加量0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g/L。发酵结束后对发酵液进行感官评价，确定最佳的菌粉添加量。

1.3.3 酵素感官评价标准

邀请10 位感官评价员进行感官评价。以气味、组织状态、口感、色泽为评价指标，对黄秋葵-火龙果酵素进行感官评价，评分标准见表1[14]。

表1 感官评分表Table 1 Sensory score table

1.3.4 正交试验法

在单因素试验的基础上，选取发酵时间、乳酸菌粉添加量、黄秋葵与火龙果添加比例、发酵温度四个因素为自变量，进行四因素三水平的正交试验，用以确定黄秋葵-火龙果酵素配方的最佳发酵工艺（见表2）。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.5 理化指标测定

（1）pH

用精密pH 计测定。

（2）可溶性固形物含量

采用数显糖度仪测定。

（3）总酸含量

采用酸碱滴定法测定酵素总酸含量，依据GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》的方法测定[15]。

（4）羟自由基清除能力测定

取稀释后的酵素样品溶液2 mL，加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L H2O2溶液2 mL，混匀静置反应10 min，再加入6 mmol/L 水杨酸乙醇溶液2 mL，混匀后置于37 ℃水浴锅恒温反应30 min，记录波长510 nm的吸光值为Ai，用双蒸水替代水杨酸溶液时测得吸光值为Aj，空白对照组以双蒸水替代样品溶液测得吸光值为A0，由公式（1）计算酵素对羟自由基的清除率[16]。

（5）色深、色调测定

参照兰圆圆等[17]的方法稍作修改，进行酵素色深、色调的测定。取适量酵素移入1 mm 的比色皿中，采用紫外分光光度计分别测定酵素在420、520、700 nm 波长处的吸光值，并按照公式（2）（3）计算，所有的操作均重复3 次。

（6）色差测定

利用色差仪对酵素溶液进行测定[18]，色差值以L*（明度）、a*（红绿值）、b*（黄蓝值）、和ΔE*（总色差）表示。

1.4 数据处理

运用Origin 8.5 绘制图表，SPSS 23.0 软件执行Duncan 方差显著性分析，数据结果用“平均值±标准差（SD）”表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同黄秋葵与火龙果比例对酵素品质的影响

由图1 可知，黄秋葵与火龙果添加比例不同，酵素的感官品质出现明显差异。当火龙果的添加比例较大时，酵素口感甜腻、不顺滑；当黄秋葵添加量较大时，酵素黏稠度较大，颜色不透亮，发酵气味浓郁，有少量沉淀等；当黄秋葵与火龙果添加比例为1∶1 时，酵素清淡爽口，口感较好，感官评分最高（95 分）。因此，初步确定黄秋葵和火龙果最佳添加比例为1∶1。

图1 不同黄秋葵与火龙果添加比例对酵素品质的影响Fig.1 Effects of addition quantitie of okra and dragon fruit on the quality of Jiaosu

2.1.2 不同发酵时间对酵素品质的影响

由图2 可知，发酵时间越长，酵素感官评分越高；当发酵时间低于48 h，酵素口感微涩；当发酵时间为72 h时，酵素口感顺滑，色泽透亮，状态均匀；当发酵时间高于72 h 时，发酵液感官评分略微下降，主要是因为随着发酵时间的延长，发酵液中的营养物质不断被消耗，代谢产物不断增加，导致乳酸菌的代谢能力降低，从而使酵素品质发生变化。发酵液中代谢产物，如有机酸，与其他产物在适宜条件下相互转化，如花青素与有机酸发生酰基化、乳酸菌将苹果酸转化为乳酸和CO2等[19]，导致酵素感官评分略有下降。在发酵时间72 h 后，酵素口感差异不大，因此，黄秋葵-火龙果酵素的发酵时间应为72 h。

图2 不同发酵时间对酵素品质的影响Fig.2 Effects of fermentation time on the quality of Jiaosu

2.1.3 不同发酵温度对酵素品质的影响

由图3 可知，随着发酵温度的升高，酵素感官评分先升高后较低。在不同的发酵温度条件下，酵素感官评分有较大差异性。在35 ℃条件下时，酵素感官评分最高，口感最好。因为植物乳杆菌最适生长温度范围为30～37℃，温度过高或过低，其生长代谢速度则会降低，导致酵素发酵不完全，口感较差[20-22]。因此，在黄秋葵-火龙果酵素发酵过程中，应选择35 ℃作为最佳发酵温度。

图3 不同发酵温度对酵素品质的影响Fig.3 Effects of fermentation temperature on the quality of Jiaosu

2.1.4 不同菌粉添加量对酵素品质的影响

由图4 可知，随着菌粉添加量的增加，酵素的感官评分不断提高。当菌粉添加量大于0.75 g/L，感官评分逐渐降低，主要是因为菌粉浓度过高时，发酵液浑浊度增加，且酵素口感变差。当菌粉添加量为0.25 g/L 时，酵素口感偏甜；接种量为0.75 g/L 时，感官评分最高，口感最好。因此，以0.75 g/L 的菌粉添加量最合适。

图4 不同菌粉添加量对酵素品质的影响Fig.4 Effects of inoculation amount on the quality of Jiaosu

2.2 正交试验结果

通过使用Design 设计四因素三水平的正交试验，以感官评分作为评价指标，由极差分析可知（表3），影响黄秋葵-火龙果酵素感官得分的主次顺序为黄秋葵与火龙果比例（A）＞发酵时间（B）＞发酵温度（C）＞菌粉添加量（D）；由感观分析方法得出黄秋葵-火龙果混合果蔬酵素的最佳工艺为A2B2C2D2，即黄秋葵和火龙果添加比例为1∶1、发酵时间72 h、发酵温度35 ℃、菌粉接种量0.75 g/L时。在最佳工艺条件（A2B2C2D2）下进行发酵制作的黄秋葵-火龙果酵素为玫红色，色泽明亮，口感协调，酸甜适中，无杂质，且带有黄秋葵和火龙果特有的香气和滋味。

表3 正交试验设计及结果Table 3 Design and result of orthogonal experiment

2.3 不同配比下的酵素性质分析

选取三个无杂质和沉淀、口感清甜且色泽明亮的酵素产品进行理化指标测定，各产品的发酵条件如下：产品1 的黄秋葵火龙果添加比例1∶2，菌粉添加量0.25 g/L，冰糖添加量100 g/L，发酵温度25 ℃，发酵时间24 h；产品2 的黄秋葵火龙果添加比例2∶1，菌粉添加量0.50 g/L，冰糖添加量120 g/L，发酵温度30 ℃，发酵时间48 h；产品3 的黄秋葵火龙果添加比例1∶1，菌粉添加量0.75 g/L，冰糖添加量140 g/L，发酵温度35 ℃，发酵时间72 h；其中产品3 是在最佳发酵工艺条件下制作的酵素产品。

2.3.1 理化指标

酵素发酵过程实际上是酸化过程，酵素发酵成功的重要参考指标是pH 值，一般值在3.0～4.0。《酵素产品分类导则》（QB/T 5324—2018）中规定，食用植物酵素一般理化指标中，液态酵素pH≤4.5；半固态酵素pH≤4.5，以《分类导则》规定液态酵素pH≤4.5 的细则。由表4 可知，三种酵素产品的pH 值在3.55～4.07 之间，均符合食用植物酵素要求。在低pH 值的环境可以抑制有害菌的产生。植物乳杆菌为兼性异型乳酸菌，利用碳源代谢产生乳酸、乙酸和酯类等代谢产物。在黄秋葵-火龙果酵素发酵过程中，植物乳杆菌利用火龙果、黄秋葵及冰糖中含有的碳源代谢产生乳酸和乙酸等有机酸，从而使酵素pH值降低[21-22]。唐敏等[14]利用乳酸菌发酵桑椹制备的酵素pH 值也在3.0～4.0 之间。

表4 不同酵素理化指标Table 4 Physics and chemistry index of Jiaosu products

总酸度是评价产品风味的一项指标，酸性条件可以抑制细菌的产生和生长，从而延长产品保质期。由表4 可知，酵素的平均总酸含量为1.05%～1.88%。总酸可以对酵素的风味起缓冲和平衡作用。当酵素的总酸量较少时，产品寡淡，无后味；当总酸含量较多时，酵素口味刺激；当总酸含量适中时，酵素口味适中，绵甜醇滑。产品2和产品3 酵素香醇可口，适合制作酵素饮品。

由表4 可知，酵素产品的可溶性固形物含量为18.37%～23.5%。当酵素中可溶性固形物含量较低时，其口感寡薄，无层次感；而可溶性固形物含量较高时，其口感过甜，食用后胃部会产生不适感。经感官评价得出酵素产品3 的可溶性固形物含量最为合适，适合做酵素产品。

2.3.2 羟基自由基清除率

羟基自由基在人体内主要是由过氧化物负离子与过氧化氢反应生成，过量的自由基会对机体造成损伤。通过测定酵素的羟自由基清除率，探究黄秋葵-火龙果酵素的抗氧化能力，结果如表5所示。三种酵素产品对羟基自由基均具有清除能力，产品3 羟基自由基的清除率最高（74.04%）。因此，黄秋葵-火龙果酵素对羟基自由基清除能力具有高效性。

表5 不同酵素的羟基自由基清除率Table 5 Hydroxyl radical scavenging of Jiaosu products

2.3.3 色深、色调

由表6 可知，酵素产品3 的色深值最大，色调值最低，主要是因为其发酵温度最高，发酵时间最长。曾光[23]研究发现影响酵素色深值变化的重要因素是温度，温度越高，色深上升的幅度也就越大，同时色调下降的幅度也增大。酵素的色深值和色调值主要与其发酵条件有关系，不同的果蔬比例、菌粉添加量、发酵时间等因素也影响黄秋葵-火龙果酵素液的色泽。

表6 不同酵素的色深值和色调值Table 6 Color depth and hue of Jiaosu products

2.3.4 色差

酵素产品的颜色变化主要与其色素物质的含量有关[24]。由表7所示，三种酵素产品的L*、a*和b*值不同，产品1 的L*值最大，说明其色泽最明亮，原因主要是酵素原料中火龙果的添加比例较大；酵素产品的a*值均为正值，说明其色泽均呈现亮红色，而b*值均为负值，则说明在发酵过程中酵素的黄色在逐渐降低，蓝色在不断加深。ΔE代表颜色变化，值越大代表颜色变化越大，三个酵素产品的颜色变化都较大。由表7 的结果可知，发酵结束后，黄秋葵-火龙果酵素呈现亮红色，赋予了酵素饮品独特的颜色特征。

表7 不同酵素的色差Table 7 Color parameters of Jiaosu products

3 结论

通过单因素试验和正交试验得到黄秋葵-火龙果混合果蔬酵素的最佳发酵工艺，即黄秋葵、火龙果添加比例为1∶1、发酵温度35 ℃、发酵时间72 h、菌粉接种量为0.75 g/L。这些因素对黄秋葵-火龙果混合果蔬酵素品质的影响由大到小依次排列为黄秋葵、火龙果的添加比量＞发酵时间＞发酵温度＞菌粉接种量。

依上述比例制成的黄秋葵-火龙果混合果蔬酵素产品，其总酸含量为1.88%，糖度值为23.5%，pH 值为4.07，羟基自由基清除率高达74.04%以上；不同发酵条件所得的酵素的色差、色调和色深存在差异性。通过对黄秋葵-火龙果酵素工艺的优化研究，可为黄秋葵酵素的工业化生产、综合性开发以及品质的优化提供理论依据和技术参考，丰富了酵素产品种类，提高了黄秋葵的附加值。