冷冻干燥乳双歧杆菌A04菌粉的贮藏活性研究

王淑敏，桑 跃，侯彩云，王鹏杰，任发政，4，王 然*

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083 2 河北省畜产食品技术创新中心 河北廊坊065201 3 中国农业大学营养与健康系 北京100091 4 中国农业大学食品质量与安全北京实验室 北京100083）

2001年，益生菌被WHO/FAO 定义为：“活的微生物，当给予足够的量时，对宿主提供健康益处”[1]。目前已有大量的研究表明，摄入益生菌可降低某些癌症的风险，缓解乳糖不耐受，治疗腹泻和炎症性肠病，增强免疫功能，降低血液胆固醇等[2-3]。此外，最近的研究表明，益生菌能够通过肠道和中枢神经系统调节胃肠道和神经精神疾病[4]。近年来，通过饮食改善健康的理念被越来越多人所接受，消费者对益生菌的兴趣日益增加，益生菌食品和膳食补充剂受到欢迎。自2016年以来，全球益生菌的消费水平迅速增加，2018年总产值为494 亿元，预计将以每年7%的速度增长，至2023年总产值达到693 亿元[5]。

为了确保益生菌的益生作用，益生菌产品在货架期终点时应至少含有106个活细胞/g[6]。由于益生菌对各种胁迫条件非常敏感，在长时间保藏过程中，活性损失是益生菌产品面临的主要问题，因此提供数量大的活细胞尤其具有挑战性[7-8]。益生菌的贮藏稳定性对于产品质量非常重要。干燥的益生菌粉与液体制剂相比具有更好的稳定性。目前，对于益生菌粉在货架期的活性或稳定性的研究尚不充分，已报道称，温度及水分是影响益生菌粉货架期存活的重要因素[9]。较高的温度会促进氧化反应或引起膜脂质相转变，从而不利于益生菌的存活[10]。而水分可以改变细菌代谢活性、物化反应速率以及玻璃化转变温度，从而影响益生菌粉的贮藏稳定性[11]。由于益生菌菌种/菌株的差异，益生菌粉在贮藏期间的活性或稳定性也存在菌种/菌株特异性。此外，关于水分对益生菌粉贮藏稳定性的研究均在水分活度恒定的基础上进行，而在实际应用过程中，通过采用隔水的包装只能确保菌粉无法从外界环境吸附水分，不能保证贮藏期间菌粉的水分活度保持恒定。本文以乳双歧杆菌A04 为研究对象，在益生菌干粉制剂实际应用场景，探究冷冻干燥A04 菌粉在不同贮藏温度条件下的水分活度、水分含量、水分分布和菌体形态的变化，以及这些变化对益生菌粉贮藏活性的影响，以期为提高A04 菌粉的贮藏稳定性，促进益生菌产品的开发与应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料与试剂

乳双歧杆菌A04（Bifidobacterium lactisA04）为本实验室分离与保存。脱脂乳，食品级，新西兰恒天然集团；海藻糖，食品级，保龄宝生物股份有限公司。

1.2 仪器与设备

水分活度仪（LabSwift-Novasina），大昌华嘉科学仪器；低场核磁共振分析仪，苏州纽迈分析仪器股份有限公司；场发射扫描电子显微镜（SU8020），日本日立公司；生化培养箱，洁净工作台、立式压力蒸汽灭菌锅、鼓风干燥箱，上海飞越实验仪器有限公司；冷冻干燥机，上海舜制仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 冷冻干燥A04 菌粉制备 活化后的乳双歧杆菌A04 以2%的接种量接种于MRS 液体培养基中，37 ℃恒pH 值（6.0）培养12 h 至稳定期前期，3 500×g，4 ℃离心10 min 收集菌体，采用无菌生理盐水洗涤2 次后，以1∶0.5 的比例重悬于10%脱脂乳和6%海藻糖混合无菌溶液中，混匀后于-80℃冷冻过夜，置于冷冻干燥机中干燥36 h，制备得到冷冻干燥A04 菌粉。本文研究选用了6 批不同初始活菌数的冷冻干燥A04 菌粉用于后续试验，分别标记为A04 低-1、A04 低-2、A04 中-1、A04中-2、A04 高-1、A04 高-2。

1.3.2 贮藏试验 将上述冷冻干燥菌粉样品采用铝箔袋密封包装后分别置于4，25，37 ℃恒温培养箱中贮藏，于第30 天、50 天、105 天取样进行后续测定。

1.3.3 水分含量及水分活度测定 冷冻干燥菌粉的水分含量测定参照AOAC 方法[12]。称取2 g 干燥菌粉置于铝盒中，于105 ℃条件下干燥直至恒重。菌粉样品的水分含量以干基计，计算公式如下：

式中：m0——铝盒质量，g；m1——烘干前盛有样品的铝盒质量，g；m2——烘干后盛有样品的铝盒质量，g。

干燥菌粉的水分活度采用水分活度仪进行测定。

1.3.4 活菌计数 采用平板计数法测定贮藏期间A04 菌粉的活菌数。称取1 g 干燥菌粉分散于9 mL 无菌生理盐水中，随后进行梯度稀释，最后取1 mL 样液涂布于MRS 固体培养基，于37 ℃厌氧培养48 h。A04 菌粉的存活率以lgNt/N0表示，其中Nt表示贮藏时间为t时的活细胞数，N0即0 d时的活细胞数。

1.3.5 皮尔逊相关性分析 皮尔逊相关性分析是度量两个或多个变量之间关系密切程度的统计学方法。采用SPSS 20 对贮藏试验监测结果进行相关性分析，得到相关系数r及显著性水平P。一般情况下，r的取值在（-1，1）之间，相关程度可分为高度相关（|r|≥0.8）、中度相关（0.5≤|r|<0.8）、低度相关（|r|<0.3）。其中r为负值时表示负相关，正值时表示呈正相关关系。P<0.05 表示有显著差异，P<0.01 表示有极显著差异。

1.3.6 水分分布 采用低场核磁PQ-001 分析仪测定A04 菌粉在贮藏期间的水分分布情况。称取1 g 干燥菌粉置于固体样品测试管中，采用CPMG序列在32 ℃条件下进行，测试参数参照Wang 等[13]的报道并稍作修改：仪器主频SF=18 MHz；90度脉宽P1=5 μs；采样点数TD=4 078；采样等待时间TW=300 ms；180 度脉宽P2=9 μs；前置放大倍数PRG=3；回波个数NECH=200/300；回波时间TE=0.101；采样频率SW=200；射频延时RFD=0.2 ms；模拟增益RG1=20 db；数字增益DRG1=3；累加次数NS=128。数据采集和分析采用MultiExpInvfit-T 软件，然后根据得到的原始数据的对数坐标构建T2 分布曲线。

1.3.7 微观形态分析 采用场发射扫描电子显微镜观察A04 菌粉的微观形貌[14-15]。称取0.1 g 干燥菌粉于10 mL 磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L）中洗涤2次，经3 500×g，4 ℃离心10 min 后，收集细胞，用2%戊二醛溶液固定过夜，然后在乙醇溶液中梯度脱水：25%，50%，70%（过夜），90%，95%和100%（3 次），最后在CO2临界点处干燥，制备的样品通过导电胶固定在铝试样盘上，用直流溅射法进行喷金处理后进行微观形貌观察。

2 结果与分析

2.1 不同批次制备的冷冻干燥A04 菌粉

为了分析冷冻干燥A04 菌粉的贮藏活性，选取了6 个批次制备得到的A04 菌粉进行贮藏试验。如表1所示，6 批A04 菌粉的水分含量均位于5.2%～6.2%之间；除A04 高-1 菌粉水分活度值偏高接近于0.1 外，其余5 个批次A04 菌粉水分活度值均处于较低水平（0.03～0.06 之间）。从活菌数的角度来看，6 批冷冻干燥A04 菌粉活菌数均较高，达到1011～1012CFU/g。

表1 不同批次冷冻干燥A04 菌粉的初始参数Table 1 The initial parameters of different batches of freeze-dried A04 powders

2.2 冷冻干燥A04 菌粉在不同贮藏温度下活菌数的变化

温度是影响干燥菌粉在贮藏期间存活的一个关键因素[9]。如图1所示，A04 菌粉在贮藏期间的活菌数均随着贮藏时间的增加而减少；且活菌数与贮藏温度呈负相关，这与Wang 等[6]的研究结果相一致。当温度≥25 ℃时，活菌数随着贮藏温度的升高而显著下降，这可能是由于在较高温度下的贮藏导致细菌细胞膜脂质氧化或发生膜脂质相转变，从而不利于细菌存活[16]。而在冷藏温度（4 ℃）下，A04 菌粉具有较好的贮藏稳定性，这是由于较低的温度条件下，微生物的代谢活性以及不利的物化反应速率较低[17]。表2 列出了不同贮藏温度下A04 菌粉在贮藏105 d 过程中的灭活率常数，6批A04 菌粉贮藏期间的灭活率不尽相同，其中A04 高-1 菌粉在贮藏期间对温度更加敏感，随着贮藏时间的增加，活菌数显著下降，其在4，25，37℃的灭活率常数分别为-4.1591×10-5，-1.3868×10-4，-7.4490×10-4；而A04 中-1 菌粉对温度敏感性最低，相应的灭活率常数分别为-2.3214×10-5，-1.4484×10-4，-2.0943×10-4。这说明益生菌粉的贮藏活性不仅与菌株有关，与菌粉的初始参数也存在一定的相关性。

表2 不同贮藏温度下冷冻干燥A04 菌粉的灭活率常数Table 2 Inactivation rate constant（k）of freeze-dried A04 powders at various storage temperatures

图1 不同批次冷冻干燥A04 菌粉贮藏期间的活菌数变化Fig.1 Changes of viable cell counts during storage of freeze-dried A04 powders

2.3 冷冻干燥A04 菌粉贮藏期间水分含量的变化

益生菌粉的贮藏稳定性在很大程度上受到水分的影响。水分含量和水分活度是表征食品中水分的两个重要指标，前者表示食品体系中总的水分含量，而后者则表示食品体系中可进行生化、生物和生理反应的水分含量。如图2所示，贮藏期间A04 菌粉的水分含量在5.2%～6.2%之间，随着贮藏温度的增加未发生显著变化，即贮藏过程中A04 菌粉的总水分水平未发生变化。这说明采用的铝箔袋包装具有良好的阻水性，可以防止菌粉在贮藏期间从环境中吸附水分。

图2 冷冻干燥A04 菌粉4，25，37 ℃贮藏期间水分含量的变化Fig.2 Changes in moisture content of freeze-dried A04 powders during storage at 4，25，37 ℃

2.4 冷冻干燥A04 菌粉贮藏期间水分活度的变化

A04 菌粉在不同贮藏温度下水分活度的变化如图3所示，在4 ℃贮藏105 d 期间，A04 菌粉的水分活度未发生明显增加；在25 ℃贮藏30 d 时，A04 菌粉的水分活度显著增加，而在随后的贮藏过程中，水分活度缓慢增加或保持相对稳定。在37 ℃贮藏105 d 过程中水分活度的变化趋势与25℃一致，但水分活度值均高于25 ℃相应的水分活度。这说明贮藏期间水分活度的变化与贮藏温度有关，在较低温度下A04 菌粉比较稳定，而在较高的温度条件下水分活度的增加可能是由于A04 菌粉中水分子与亲水基团之间分子键的断裂所致[18]。本研究中，A04 菌粉中添加的干燥基质（海藻糖、脱脂乳粉）可能与贮藏期间水分活度的增加有关，因为碳水化合物和蛋白质等亲水分子中含有较多的亲水基团以及氢键等化学键[19]。此外，在所有贮藏温度下，A04 中-1 菌粉的水分活度值最低，A04 高-1 菌粉水分活度值最高，这可能与其初始（0 d）的水分活度值有关。

图3 4，25，37 ℃贮藏期间冷冻干燥A04 菌粉水分活度的变化Fig.3 Changes in water activity of freeze-dried A04 powders during storage at 4，25，37 ℃

2.5 A04 菌粉贮藏试验结果Pearson 相关性分析

为了探讨贮藏温度、菌粉水分活度对贮藏期间A04 菌粉存活的影响，对贮藏试验结果进行了皮尔逊相关性分析，结果如表3所示。贮藏期（30，50，105 d）损失活菌数与贮藏温度呈显著正相关（相关系数分别为0.888，0.820 和0.748）。目前已有大量研究证实，干燥的益生菌培养物在贮藏期间的死亡与较高的贮藏温度有关[6]。De 等[20]研究显示，微胶囊化鼠李糖乳杆菌在7 ℃贮藏120 d 后活细胞数减少1 lg（CFU/g），但在25 ℃贮藏相同时间后活细胞减少了1.5 lg（CFU/g）。对于益生菌粉来说，较低的贮藏温度（冷冻或冷藏）有利于其贮藏期间的存活。然而，由于当前食品及医药行业市场对即食食品的需求，益生菌粉需要在室温下保持稳定，因此，降低益生菌对温度的敏感性是提高益生菌粉贮藏活性或稳定性的一个可行策略。

表3 冷冻干燥A04 菌粉水分活度、初始菌数、贮藏温度与活菌数的相关性分析Table 3 Correlation analysis between water activity,initial bacterial counts,storage temperature and viable cell counts of freeze-dried A04 powders

贮藏30 d 及50 d 时，A04 菌粉损失活菌数与相应贮藏期水分活度显著正相关（相关系数分别为0.690，0.639）；贮藏105 d 时，损失活菌数与水分活度呈极显著正相关（相关系数为0.713）。此外，贮藏期（30，50，105 d）水分活度与初始水分活度也呈极显著正相关（相关系数分别为0.764，0.813 和0.872）。从相关性分析结果可知，A04 菌粉的初始及贮藏期水分活度对益生菌贮藏期间的存活具有显著影响。不论贮藏温度如何，A04 高-1菌粉的水分活度均不低于0.1，明显高于其它批次A04 菌粉，导致贮藏活性显著降低。研究表明，较低的水分活度往往伴随着较低的代谢活性、物化反应速率以及较高的玻璃化转变温度[21-22]。此外，贮藏期间酶活性的保持也依赖于贮藏期间的水分活度[7]。因此，维持较低的水分活度（＜0.1）有利于提高A04 菌粉的贮藏稳定性。但是水分活度与贮藏稳定性之间并非始终呈负相关关系，过低的水分活度值或过度干燥不利于益生菌粉的贮藏稳定性[23]。已有研究证实过度干燥会导致细菌较高的死亡率[17]。维持合适的水分活度有助于延长益生菌粉的货架期，本研究中，A04 菌粉的水分活度贮藏期间保持在0.03～0.1 之间时具有较好的贮藏稳定性。

2.6 冷冻干燥A04 菌粉贮藏期间水分分布的变化

根据上述贮藏试验结果，A04 中-1 菌粉具有较好的贮藏稳定性。为了进一步分析贮藏期间水分活度增加的原因，对A04 中-1 菌粉在4，25，37℃贮藏期间的T2 弛豫曲线以及水分分布进行了分析，结果如图4所示。从图4d 中可以看出，在贮藏期间A04 菌粉中结合水的含量均高于90%，这是由于干燥A04 菌粉的水分含量较低，水分主要以结合水的形式存在。在4 ℃贮藏期间，A04 菌粉中结合水含量稍有降低；而在25 ℃及37 ℃贮藏期间，A04 菌粉中结合水含量随着贮藏时间的增加明显降低，这表明在贮藏期间A04 菌粉中水分可能发生了转变，一部分结合不牢固的结合水转化为不易流动水或自由水，从而导致菌粉在贮藏过程中水分活度显著增加，而水分含量未发生明显变化。此外，在贮藏期间随着贮藏温度的增加，A04 菌粉中结合水含量降低，这说明水分子转化（迁移）与贮藏温度呈正相关，温度越高，水分子运动速率越快。微生物细胞周围水分子的迁移（转化）影响其在贮藏期间的存活，因此，为了更好地保藏干燥菌粉，贮藏期间的水分活度需要控制在较低的水平（＜0.1）且保持相对恒定。

图4 在4 ℃（a）、25 ℃（b）、37 ℃（c）贮藏期间冷冻干燥A04 菌粉的T2 弛豫曲线和结合水含量（d）的变化Fig.4 Changes of T2 relaxation curve during storage at 4 ℃（a）,25 ℃（b）,37 ℃（c）and bound water content（d）of A04 freeze-dried powder

2.7 冷冻干燥A04 菌粉贮藏期间菌体形态的变化

A04 菌粉在不同温度（4，25，37 ℃）条件下贮藏0～105 d 的菌体形态如图5所示。在贮藏过程中观察到A04 细胞包膜的损伤，且随着贮藏温度及贮藏时间的增加细胞损伤程度增大，甚至出现部分细胞裂解现象。在贮藏0 d 时，大部分菌体细胞饱满且表面光滑，无明显细胞变形。在4 ℃贮藏105 d 期间，菌体形态未发生显著变化，细胞表面仅出现轻微皱缩现象。在25 ℃条件下，随着贮藏时间的增加，细胞表面出现明显皱缩，贮藏105 d时（图5e）可观察到部分菌体细胞表面有明显的孔洞出现。37 ℃条件下贮藏50 d（图5f）时观察到部分菌体细胞表面出现孔洞，贮藏105 d 时菌体形态损伤程度加大，部分菌体细胞开始裂解。这表明贮藏期间A04 细胞表面发生变形，随着贮藏温度及时间的增加，细胞从皱缩变形、出现孔洞到开始裂解，菌体形态的这种损伤最后导致A04 细胞死亡。Nag 等[24]也发现在贮藏过程中菌体细胞表面出现变形。此外，有研究指出，细菌细胞的皱缩变形与细胞完整性的丧失、代谢活性以及存活具有相关性[25]。

图5 贮藏期间冷冻干燥A04 菌粉菌体形态的变化（20 000X）Fig.5 Changes of bacterial morphology during storage of A04 freeze-dried powder（20 000X）

3 结论

益生菌粉在货架期的稳定存活对于其发挥益生作用，以及益生菌行业的发展均具有重要意义。本试验以乳双歧杆菌A04 为研究对象，探讨冷冻干燥A04 菌粉在不同贮藏温度下的水分特性、菌体形态的变化及这些变化对菌株存活的影响。结果显示，A04 菌粉贮藏期间的存活与贮藏温度、水分活度显著负相关。当贮藏温度高于25 ℃时，A04菌粉的存活率显著下降。此外，贮藏期间菌粉中部分结合水转化成不易流动水或自由水，导致水分活度显著增加，这与较高的贮藏温度以及干燥基质组分有关。研究结果表明，水分活度是影响益生菌粉贮藏活性的一个关键因素，在贮藏过程中，维持合适的水分活度（0.03～0.1）有利于A04 的存活，同时保持水分活度的稳定对于A04 菌粉的贮藏稳定性也十分重要。本研究首次以益生菌粉制剂实际应用场景为基础，监测益生菌粉的贮藏活性，这为益生菌粉的实际生产应用奠定了理论基础。

在益生菌粉产品的生产中，应优化干燥工艺，明确制备稳定益生菌粉的加工参数；并以贮藏活性或稳定性为指标，筛选干燥基质及赋形剂，确定有利于干燥菌粉贮藏的水分活度，将有利于制备室温条件下长时间保藏的益生菌粉制剂，促进益生菌产品的开发及大规模应用。