洋甘菊总黄酮体外抗肿瘤活性研究

龙 婷,波拉提·马卡比力,兰 卫*,王 莹

(1.新疆医科大学中医学院,新疆 乌鲁木齐 830011;2.新疆维吾尔自治区药物研究所,新疆 乌鲁木齐 830004;3.新疆医科大学附属中医医院,新疆 乌鲁木齐 830002)

癌症是全球死亡率最高的疾病之一,其特征是由于启动剂的作用导致细胞机制异常或 DNA 突变,从而导致细胞不受控制异常生长[1]。多种强效合成抗癌药物被用于临床治疗癌症,在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞的毒副作用较严重,此外肿瘤细胞也易产生耐药性。研究表明,可通过单独或组合使用天然化合物来克服抗癌药物相关的不良反应[2],其中针对黄酮类化合物的研究较多[3]。

洋甘菊(MatricariachamomiliaL.),又称母菊,维药名巴木乃,是菊科植物德国洋甘菊的干燥全草或花序,采收于夏秋季,是传统医学和民间常用药材之一[4]。现代药理学研究表明,洋甘菊具有抗肿瘤[5]、抗病毒、氧化应激的神经保护、抗焦虑、抗抑郁[6]、降血糖血脂[7-8]、抑菌等作用。目前,关于洋甘菊抗肿瘤活性的研究报道较少。基于此,作者采用CCK-8法研究洋甘菊总黄酮(MCTF)对人肺癌细胞A549、人胃癌细胞 AGS、人宫颈癌细胞HeLa及SiHa、人食管癌细胞 Eca-109及TE-1、人肝癌细胞HepG2体外增殖的抑制作用,并采用流式细胞术检测洋甘菊总黄酮对SiHa细胞周期分布及凋亡率的影响,为后续进一步探究洋甘菊抗肿瘤的临床应用提供数据参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

洋甘菊,经鉴定为德国洋甘菊的干燥全草。人肺癌细胞A549、人胃癌细胞AGS、人宫颈癌细胞HeLa及SiHa、人食管癌细胞Eca-109及TE-1、人肝癌细胞HepG2,均由新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院提供。

0.25%胰蛋白酶(批号 2186974)、胎牛血清(FBS,批号70101002),美国Gibco公司;DMEM培养基(批号SH30022.01)、磷酸盐缓冲液(PBS,批号SV30010),美国Hyclone公司;青霉素+链霉素双抗(批号Bj111995904),Biosharp公司;二甲基亚砜(DMSO,批号EZ6789B127),德国BioFroxx公司;细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8,批号BA00208),北京博奥森生物技术有限公司;周期检测试剂盒(PI,批号40301ES60),翊圣生物公司;凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC,批号AO2001-02P-G),天津三箭生物技术公司。

SW-XJ-2F型超净台,苏州安泰空气技术有限公司;371型直热式CO2恒温培养箱,Thermo公司;TDL-5-A型低速离心机,上海安亭科学仪器厂;IX71-5-12FL/PH型倒置荧光三目显微镜,Roperscientific公司;Benchmurk PLUS型全波长酶标仪,Bio-Rad公司;TCS SP8型激光共聚焦显微镜,德国Leica公司;AB104-N型电子分析天平,上海Mettler-Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 MCTF的提取

在课题组前期研究[9]的基础上,取适量洋甘菊粉末,按料液比1∶12(g∶mL)加入70%乙醇回流提取2 h,提取3次,合并提取液,浓缩;浓缩液经D-101/AB-8 大孔吸附树脂纯化,收集洗脱液;60 ℃旋转蒸发除去乙醇,干燥,得到含量为56%(UV)[10]的MCTF。

1.2.2 储备液的制备

称取MCTF约 50 mg,溶于0.5 mL DMSO中,振荡摇匀,封口后储存于4 ℃环境中。

1.2.3 细胞培养

A549、AGS、HeLa、SiHa、Eca-109、TE-1和HepG2细胞复苏后分别接种于含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基中,置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。次日换液,及时传代,取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.4 MCTF抗肿瘤活性的测定

分别取对数生长期的A549、AGS、HeLa、SiHa、Eca-109、TE-1和HepG2细胞,用PBS缓冲液清洗2次,加入1 mL胰蛋白酶消化60 ～ 90 s,然后加入2～3 mL新鲜培养基终止消化,1 000 r·min-1离心5 min,弃上清,再加入1 mL DMEM培养基吹打均匀,制成单细胞悬液。单细胞悬液以每孔5×104个·mL-1接种至96孔板中,置于培养箱中培养24 h,长至40%～50%时,弃培养基,每孔加入100 μL不同浓度(25、50、100、150、200、300、450、600,μg·mL-1)的MCTF溶液,设置正常对照组(不加MCTF溶液)和空白组(不加肿瘤细胞),每孔设置3个复孔;分别在培养箱中孵育24 h、48 h后,弃培养基,加入100 μL 10%CCK-8试剂,置于培养箱中继续孵育1 h,采用酶联免疫检测仪测定450 nm 处吸光度(OD)。按式(1)计算样品对细胞增殖的抑制率,并通过Graphpad 软件计算半数抑制浓度(IC50),以IC50值作为评价MCTF对不同肿瘤细胞的毒性指标。

(1)

1.2.5 SiHa细胞的分组及培养

SiHa细胞悬液以2×106个·mL-1接种至6孔板中,设置正常对照组、顺铂组(15 μg·mL-1)、MCTF给药组(25、50、100,μg·mL-1),每组设置3 个复孔,培养24 h后,给药48 h,观察细胞形态。

1.2.6 PI 单染法检测细胞周期变化

SiHa细胞悬液以2×106个·mL-1接种至6孔板中,设置正常对照组、顺铂组(15 μg·mL-1)、MCTF给药组(25、50,μg·mL-1),每组设置3 个复孔,贴壁24 h后,给药24 h;弃培养液,用预冷的PBS缓冲液清洗1次,胰蛋白酶消化,1 000 r·min-1离心5 min;弃上清,用PBS缓冲液再次洗涤,1 000 r·min-1离心5 min;弃去上清,加入预冷的70%乙醇0.5 mL,在-20 ℃冰箱中静置12～24 h。 将固定好的细胞1 000 r·min-1离心5 min,弃上清,用PBS缓冲液清洗2次,再加入0.5 mL PI染色液,避光染色15 min后上机检测。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

分组及给药方式同1.2.6方法,收集消化后的SiHa细胞悬液于对应的EP管中,1 500 r·min-1离心5 min,弃上清并弹匀细胞;加入2 mL PBS缓冲液,离心5 min后,弃上清,重复操作2次;将细胞重悬于500 μL Binding Buffer中,分别加入5 μL Annexin V-FITC和PI染色液,轻轻混匀,37 ℃避光染色10 min,并在1 h内通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,重复3次,按式(2)计算SiHa细胞总凋亡率(%):

总凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率

(2)

1.3 统计学分析

2 结果与讨论

2.1 MCTF对肿瘤细胞形态的影响

用倒置显微镜观察各实验组细胞,与空白对照组相比,MCTF给药组细胞形态均发生改变,观察到细胞密度显著降低,且随着MCTF浓度的增加,细胞逐渐变亮、变圆;在300 μg·mL-1、450 μg·mL-1、600 μg·mL-1浓度下,大部分肿瘤细胞均无法维持完整的细胞形态。

2.2 MCTF对肿瘤细胞增殖的抑制作用

不同浓度MCTF分别作用24 h、48 h时对肿瘤细胞增殖的抑制率如表1所示,对肿瘤细胞的IC50值如表2所示。

表1 MCTF对不同肿瘤细胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rates of different tumor cells by MCTF

表2 MCTF对不同肿瘤细胞的IC50值Tab.2 IC50 values of MCTF to different tumor

从表1、表2可以看出,MCTF对7种肿瘤细胞增殖均有不同程度的抑制作用,其中对SiHa细胞的抑制作用最强,作用24 h、48 h 时,IC50值分别为(130.23±2.98) μg·mL-1、(97.74±4.02) μg·mL-1,当MCTF浓度为200 μg·mL-1时,对SiHa细胞的抑制率高达97%以上。表明,MCTF在一定浓度范围内对不同肿瘤细胞的抑制作用存在差异,MCTF抗肿瘤作用具有一定的选择性和敏感性。

2.3 MCTF对SiHa细胞形态的影响

用倒置显微镜观察各实验组细胞形态, 结果如图 1 所示。

从图1可以看出,与正常对照组比较,不同浓度的MCTF给药组细胞形态发生改变,低剂量组(25 μg·mL-1)细胞形态接近正常对照组,但细胞密度低于正常对照组,且随着MCTF浓度的增加,细胞密度显著降低,细胞逐渐变亮、变圆,并出现破裂、空泡、聚团、碎片等现象。

图1 MCTF对SiHa细胞形态的影响Fig.1 Effect of MCTF on morphology of SiHa cells

2.4 MCTF对SiHa细胞周期分布的影响

利用低、中剂量(25 μg·mL-1、50 μg·mL-1,下同)的MCTF干预 SiHa细胞 24 h 后,通过流式细胞术检测细胞周期,结果如图2和表3所示。

a.正常对照组 b.25 μg·mL-1MCTF c.50 μg·mL-1MCTF

表3 MCTF对SiHa细胞周期分布的影响Tab.3 Effect of MCTF on cycle distribution of SiHa cells

从图2、表3可以看出,相较于正常对照组,低、中剂量组细胞G0/G1期分布比例下降,S期、G2/M期分布比例上升,且具有极显著性差异(P<0.01),说明MCTF使SiHa细胞阻滞在G0/G1期,阻断细胞的DNA合成,停止细胞分裂,抑制细胞增殖。

2.5 MCTF对SiHa细胞凋亡率的影响

利用低、中剂量的MCTF干预SiHa细胞24 h后,考察MCTF 对SiHa细胞凋亡率的影响,结果如图3和表4所示。

a.正常对照组 b.25 μg·mL-1MCTF c.50 μg·mL-1MCTF

表4 MCTF对SiHa细胞凋亡率的影响Tab.4 Effect of MCTF on apoptosis rate of SiHa cells

从表4可以看出,与正常对照组比较,低、中剂量的MCTF干预SiHa细胞 24 h,对细胞晚期(Q2)影响极显著,且总凋亡率由5.88%±0.29%分别升至11.57%±0.27%、18.08%±1.63%。表明,低剂量MCTF即可诱导SiHa细胞凋亡。

2.6 讨论

洋甘菊提取物中总黄酮含量高达 6%,主要包括柚皮苷元(黄烷酮)、芦丁(黄酮醇)、木犀草素和木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷(占总黄酮的17%)[11]。Shebbo等[12]研究发现,洋甘菊提取物对二甲肼(DMH)诱导的中期阶段结直肠癌小鼠肝脏有保护作用,通过降低AST和ALT水平,调节Wnt信号通路,抑制肝细胞增殖,进而减轻肝损伤。El Joumaa等[13]研究发现,洋甘菊提取物可有效降低DMH诱导的小鼠大肠癌发病率,通过调节Wnt途径,下调Wnt5-α、β-catenin、T细胞因子(Tcf4)、Cyclin D1水平,降低COX-2 和iNOS活性来抑制肿瘤细胞增殖,而COX-2和iNOS在炎症实验模型和肿瘤生长中起着关键作用。联合使用洋甘菊和纳米银(AgNPs)是治疗肺癌的一种有效策略,洋甘菊水提物合成的AgNPs对A549细胞具有剂量和时间依赖性的细胞毒作用[14]。研究显示,洋甘菊提取物对乳腺癌细胞[15](T-47D、MCF-7、MDA-MB-468)、前列腺癌细胞(LNCaP、PC-3、DU145)、结肠癌细胞(RKO)和纤维肉瘤细胞(HT1080)均有不同程度的抑制和促凋亡作用[16]。

本研究以MCTF为药物基础,选取7种肿瘤细胞A549、AGS、HeLa、SiHa、Eca-109、TE-1及HepG2,探讨MCTF的体外抗肿瘤活性。结果表明,MCTF对7种肿瘤细胞增殖均有一定的抑制作用,其中对SiHa细胞的抑制作用最强。MCTF 干预SiHa细胞后,细胞形态改变,并使细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制细胞生长,促进细胞凋亡。但本研究对MCTF抑制SiHa细胞是初步研究,后期需进一步通过细胞相关表征(迁移、侵袭)及相关的蛋白实验数据来支撑;关于MCTF抑制SiHa细胞的具体机制,可以基于蛋白组学、代谢组学、生物信息技术寻找相关的靶蛋白及对应的通路进行深入分析。

3 结论

采用CCK-8法研究了MCTF对人肺癌细胞A549、人胃癌细胞AGS、人宫颈癌细胞HeLa及SiHa、人食管癌细胞Eca-109及TE-1、人肝癌细胞HepG2体外增殖的抑制作用,并采用流式细胞术检测了MCTF对SiHa细胞周期分布及凋亡率的影响。结果表明,与空白对照组比较,MCTF对7种肿瘤细胞增殖均有不同程度的抑制作用,其中对SiHa细胞的抑制作用最强,作用48 h的IC50值为(97.74±4.02) μg·mL-1;低、中剂量组(25 μg·mL-1、50 μg·mL-1)干预SiHa细胞24 h后,细胞阻滞在G0/G1期,总凋亡率由5.88%±0.29%分别升至11.57%±0.27%、18.08%±1.63%,说明低剂量洋甘菊总黄酮可抑制SiHa细胞增殖,诱导SiHa细胞凋亡。为后期MCTF抑制SiHa细胞的作用机制研究奠定了基础。