新型异噻唑啉酮衍生物抑菌活性及作用机制研究

周 静,闫林林,薛 超,宋晓宁,刘靖丽,张炳烛*

(1.陕西中医药大学药学院,陕西 咸阳 712046;2.河北化工医药职业技术学院,河北 石家庄 050026;3.西安近代化学研究所,陕西 西安 710065;4.河北工业大学化工学院,天津 300401)

异噻唑啉酮类化合物具有高效、易降解、环境友好等特点[1],其对细菌[2]、真菌[2]、藻类[3]都具有很高的抑制活性,还具有抗炎、止痛、解热[4]、解痉[5]、抗血小板凝集[6]等生理活性,被广泛应用于涂料、造纸、皮革、工业循环水、农药、海洋防污及化妆品等领域[7]。亚砜结构具有重要的生理活性,在医药和农药领域被广泛应用[8]。为了寻找抑菌活性更高、抑菌范围更广、毒性更低的抑菌剂,作者所在研究团队[9]在五元环双键上引入不同取代基,并引入2个羰基,以增加分子与靶点形成氢键的可能性,进而增强分子与靶点的结合度,合成了21个带有亚砜结构的多羰基新型异噻唑啉酮衍生物1a～1q、2、3、4(图1)。

图1 异噻唑啉酮衍生物Fig.1 Isothiazolinone derivatives

葡糖胺-6-磷酸合成酶(G-6-P合酶)催化D-果糖-6-磷酸和L-谷氨酰胺分别生成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸,是己糖胺代谢和细胞壁合成反应的第一步,终产物N-乙酰葡糖胺是细菌细胞壁构建的基本模块。因此,G-6-P合酶是抑菌剂的重要靶点[10]。

基于此,作者以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、烟草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)和大肠杆菌(Escherichiacoli)为供试菌,采用滤纸片扩散法测定20个新型异噻唑啉酮衍生物的抑菌活性;选取高抑菌活性衍生物,使用AutoDock软件进行分子对接,分析其与G-6-P合酶的相互作用模式;运用密度泛函(DFT)方法对高抑菌活性衍生物的分子静电势进行理论计算,揭示化合物结构与活性之间的关系。

1 实验

1.1 供试菌、培养基与试剂

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、烟草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、大肠杆菌(Escherichiacoli),均由西北农林科技大学农药研究所提供。

牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化钠15.0 g,蒸馏水800 mL,琼脂15.0 g。

所用试剂均为市售分析纯;液体试剂用前均按照标准操作进行纯化处理。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性测定

采用滤纸片扩散法测定抑菌活性。将提前活化好的细菌用无菌水刷下来,制成菌悬液,然后和牛肉膏蛋白胨培养基混匀,取3 mL于直径9 mm的培养皿中,制成带菌培养基。将20个新型异噻唑啉酮衍生物分别溶于丙酮,配制成1 000 μg·mL-1的衍生物溶液;吸取5 μL衍生物溶液,涂在直径5 mm的滤纸片上,晾干,以相同浓度的链霉素为阳性对照、丙酮为空白对照,每组设置3个平行实验;将晾干的滤纸片贴在带菌培养基上,每皿贴3片,并确保滤纸片完全贴敷于培养基上,置于37 ℃恒温培养箱中培养一定时间(4～10 h),用十字交叉法测量抑菌圈直径,观察抑菌圈透明度。

1.2.2 分子对接模拟

从PDB数据库(http://www.rcsb.org)中选取Mouilleron等[11]报道的G-6-P合酶(PDB ID:2VF5)作为受体,选取高抑菌活性衍生物作为配体,使用AutoDock 4.2软件进行分子对接研究,使用ChemDraw Ultra 19.0软件进行三维定向绘制和优化,并使衍生物能量最小化,使用PyMOL软件对配体-蛋白质相互作用进行可视化分析。

1.2.3 分子静电势计算

选取高抑菌活性衍生物为研究对象,采用DFT方法,在B3LYP/6-311++G**水平上进行结构优化和频率计算。最优结构均无虚频,说明优化得到的是能量极小的稳定结构。在此基础上计算衍生物的分子静电势和NBO(natural bond orbital)电荷。所有计算均由Gaussian 16程序完成。

2 结果与讨论

2.1 新型异噻唑啉酮衍生物的抑菌活性

采用滤纸片扩散法测定了20个新型异噻唑啉酮衍生物对5种供试菌的抑菌活性,结果见表1。

表1 20个新型异噻唑啉酮衍生物对5种供试菌的抑菌活性Tab.1 Antibacterial activities of 20 novel isothiazolinone derivatives to 5 tested bacteria

由表1可知:与链霉素相比,11个衍生物(1a、1c、1d、1f、1g、1i、1j、1k、1l、1q、4)对蜡状芽孢杆菌具有一定的抑制作用,说明衍生物分子空间结构对抑菌活性有一定影响,且R2不宜为强吸电子基团;3个衍生物(1c、1g、1i)对枯草芽孢杆菌具有一定的抑制作用,说明当五元环氮原子上连有苯环且苯环上没有吸电子基团时,抑菌活性较高;3个衍生物(1a、1c、1h)对烟草青枯病菌具有一定的抑制作用,说明当R1为苯或取代苯、五元杂环上有甲基酮时,抑菌活性较高;3个衍生物(1a、1c、1i)对大肠杆菌具有一定的抑制作用,说明当五元环氮原子上连有苯环且苯环上为弱给电子基团、五元杂环上有甲基酮时,抑菌活性较高;衍生物1a和1c对蜡状芽孢杆菌、烟草青枯病菌和大肠杆菌的抑制作用尤为突出;衍生物1g对5种供试菌均具有一定的抑制作用,尤其是对蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用较强;衍生物1h、1i对蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、烟草青枯病菌和大肠杆菌均具有一定的抑制作用,其中1i对蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑制作用均高于链霉素。

2.2 新型异噻唑啉酮衍生物的抑菌机制

为了研究新型异噻唑啉酮衍生物的抑菌机制,验证配体-受体结合,选取高抑制活性的异噻唑啉酮衍生物1a、1c、1g、1h、1i作为配体,分别与受体G-6-P合酶进行分子对接,其对接结合能与氢键见表2,作用模式见图2。

图2 分子对接作用模式Fig.2 Action mode of molecular docking

由表2和图2可知,5个高抑菌活性衍生物与G-6-P合酶口袋中的不同氨基酸均有较好的结合。其中抑菌活性最高的衍生物1c与G-6-P合酶的结合模式三维图如图3所示。

由图3可知,衍生物1c通过氢键、π-烷基、π-S、碳氢相互作用等多种方式与受体G-6-P合酶很好地对接。衍生物1c分别与受体G-6-P合酶的Gln348(d=2.0 Å)、Ser303(d=1.8 Å)、Thr302(d=2.1 Å、2.7 Å)形成4个氢键,这些氢键的形成使得它们的结合更紧密;此外,各种疏水作用力也使得衍生物1c能以较小的能量稳定结合在G-6-P合酶口袋中。表明,新型异噻唑啉酮衍生物尤其是1c可以与G-6-P合酶很好地结合,其抑菌机制可能是新型异噻唑啉酮衍生物很好地抑制了G-6-P合酶活性。

2.3 新型异噻唑啉酮衍生物的分子静电势

分子的静电势可以预测药物分子的活性位点,揭示药物分子与受体蛋白之间的相互作用,阐明药物分子的结构与药理活性之间的关系。在B3LYP/6-311++G**水平上计算5个高抑菌活性异噻唑啉酮衍生物的分子静电势,结果如图4所示。

注:深色区域代表负的静电势区域,是衍生物亲电反应的活性位点;浅色区域代表正的静电势区域,是衍生物亲核反应的活性位点。图4 5种高抑菌活性异噻唑啉酮衍生物的分子静电势Fig.4 Molecular electrostatic potential of 5 isothiazolinone derivatives with high antibacterial activity

药物分子周围的静电势映射的差异反映其活性位点与受体结合的强弱。由图4可知,负的静电势区域(深色区域)分布在衍生物的羰基和亚砜基团上,正的静电势区域(浅色区域)分布在苯环上,表明这些区域是衍生物的活性位点,可以与受体G-6-P合酶发生相互作用。这一结论与分子对接结果一致。

3 结论

采用滤纸片扩散法测定了20个新型异噻唑啉酮衍生物对5种常见细菌的抑菌活性,筛选到5个高抑菌活性衍生物,这5个衍生物均能通过氢键、π-烷基、π-S和碳氢相互作用等多种方式与G-6-P合酶较好地结合,多个羰基和亚砜结构的存在起到了关键作用。分子静电势分析表明,负静电势的羰基和亚砜基团区域是衍生物的活性位点,可以与受体G-6-P合酶发生相互作用。新型异噻唑啉酮衍生物的抑菌机制可能是很好地抑制了G-6-P合酶活性。该类多羰基含亚砜结构的异噻唑啉酮衍生物具有进一步研究的意义和潜在的应用价值。