糖基化金纳米笼复合物的制备及性质研究

张倩茹,梁梅芳,权 静,2*

(1.东华大学生物与医学工程学院,上海纳米生物材料与再生医学工程技术研究中心,上海 201620;2.区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室,广西区域性高发肿瘤早期防治研究重点实验室,广西 南宁 530022)

金纳米笼(AuNCs)具有中空多孔状结构,不仅可吸收近红外波段(700～1 200 nm)的光波使其具有高光热转换效率,而且金纳米笼空心内壁和多孔壁结构有利于装载小分子、酶及药物等,在生物医药领域备受关注[1-7]。然而,裸金纳米笼容易发生聚沉现象,不能稳定分散,在其表面接枝基团得到功能化金纳米笼复合物可在改善其稳定性的同时拓展其功能性,使其在医药领域具有更广泛的应用前景[8]。Hu等[9]将引发剂负载于金纳米笼,利用其光热效应引起肿瘤细胞ROS升高,从而诱导肿瘤细胞凋亡。Shi等[10]在金纳米笼表面修饰 pH 响应的荧光探针,用于指示肿瘤位置,从而通过化疗和热疗促进肿瘤细胞凋亡。

将靶向基团修饰在金纳米笼表面,可为金纳米笼粒子的靶向光热治疗提供可能性。糖基聚合物是指一种通过不同化学反应将糖基组分引入到聚合物侧链或端基的功能性高分子材料[11],不仅保持了糖分子良好的生物相容性和可降解性,而且便于利用糖-蛋白的特异性识别将纳米复合材料靶向运输到给药部位实现精准给药,提高药物运输效率[12-18]。

作者在课题组前期研究[19]的基础上,将糖基聚合物P(DEGMA-co-OVNGlu)接枝到金纳米笼表面制备糖基化金纳米笼复合物AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu),采用紫外可见吸收光谱(UV-Vis)和透射电镜(TEM)等对其进行表征[20],系统研究其理化性质和光热转换效率,并考察糖基化金纳米笼复合物与凝集素ConA的特异性识别作用,为后续金纳米笼复合物的肿瘤靶向治疗提供纳米平台。

1 实验

1.1 试剂与仪器

2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(DEGMA)、S-十二烷基-S′-(2-羧基异丙基)三硫酯(DDATC),美国西格码奥德里奇公司;6-O-乙烯基己二酸-D-吡喃型葡萄糖(OVNGlu),自制;偶氮二环己基甲腈(ACCN),天津光复精细化工研究所;葡萄糖,阿拉丁生化科技有限公司;50 nm金纳米笼,西安瑞禧生物科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF),上海凌峰化学试剂有限公司;硼氢化钠(NaBH4),国药集团化学试剂有限公司;实验用水为超纯水。

AVANCE 400型核磁共振波谱仪,瑞士Bruker公司;JEM-2100型透射电子显微镜(TEM),日本JEOL公司;Lambda 35型紫外可见分光光度计,日本PerkinElmer公司;Nexus-670型傅立叶变换红外光谱仪(FTIR),美国Thermo公司;DZF-6021型真空干燥箱,上海坦泽仪器设备有限公司;DT-8891E型热电偶温度计,华盛昌(深圳)公司;ADR-1860型激光器,熙隆光电科技有限公司;3-30KS型离心机,美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 糖基化金纳米笼复合物的制备

以DEGMA、OVNGlu为原料,参照文献[19]采用酶促可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合法制备糖基聚合物P(DEGMA-co-OVNGlu)。在避光条件下将2 mL 0.05 mg·mL-1金纳米笼溶液和5 mL 0.1 mg·mL-1糖基聚合物溶液充分混合,每隔30 min加入0.5 mL 0.01 mol·L-1NaBH4溶液;连续5次后室温避光,搅拌过夜;9 000 r·min-1离心10 min,重复2次,即得糖基化金纳米笼复合物AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu)。

1.2.2 分子量的测定

室温下,保持流速为1 mL·min-1,将含糖量不同的糖基聚合物分别溶解于DMF中,得到浓度约5 mg·mL-1的待测溶液,经0.45 μm的有机相针式过滤器过滤,滤液注射到样品瓶中,采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定分子量。

1.2.3 低临界溶解温度(LCST)的测定

在20～60 ℃范围内分别测定0.5 mg·mL-1糖基聚合物溶液和0.1 mg·mL-1糖基化金纳米笼复合物溶液在500 nm处的吸光度;样品池按0.5 ℃·min-1的升温速率进行升温。LCST指通过变温紫外测定温敏聚合物达到溶液最大吸光度的50%时所对应的温度。

1.2.4 紫外可见吸收光谱分析

配制Au浓度相同的金纳米笼溶液和糖基化金纳米笼复合物溶液,在400～1 000 nm范围内进行全波长扫描,绘制吸光度变化曲线。

1.2.5 光热性能评价

取200 μL不同Au浓度(4、8、12、16、20,μg·mL-1)的糖基化金纳米笼复合物溶液,在不同强度(0.8、1.0、1.2、1.4、1.6,W·cm-2)的808 nm激光下照射 300 s,利用热电偶温度计实时记录溶液温度,绘制T-t的变化曲线,并按下式计算糖基化金纳米笼复合物的光热转换效率(η):

(1)

(2)

(3)

式中:Qdis为光热光谱分析的材料系数,mW;m和C分别为水的质量(mg)和比热容(J·kg-1·℃-1);ΔT为温差,℃;t为激光照射时间,s;h为传热系数,W·m-2·℃-1;S为表面积,m2;mi和Cp,i分别为溶液中不同物质的质量(mg)和比热容(J·kg-1·℃-1);τ为传热时间常数,s;Tmax和Tamb分别为溶液最高温度和初始温度,℃;I为激光的功率,W·m-2;A808为材料在808 nm处的特征吸收峰强度值。

1.2.6 凝集素ConA的识别测定

在37.0 ℃恒温水浴锅中,于0.05 mg·mL-1糖基化金纳米笼复合物溶液中加入等体积的0.02 mg·mL-1的凝集素ConA,利用紫外浊度法与纳米粒度仪分别测定糖基化金纳米笼复合物溶液在与ConA识别前后的吸光度及粒径。

2 结果与讨论

2.1 分子量及LCST分析

当OVNGlu在糖基聚合物P(DEGMA-co-OVNGlu)中的含量n(OVNGlu)∶n[P(DEGMA-co-OVNGlu)]为2.89∶1时,糖基聚合物的Mn为3.49×104,Mw为4.76×104,分散性指数(PDI)为1.36,LCST可达40.3 ℃。

2.2 糖基聚合物和糖基化金纳米笼复合物的温敏性(图1)

图1 0.5 mg·mL-1糖基聚合物溶液(a)及0.1 mg·mL-1糖基化金纳米笼复合物溶液(b)的吸光度随温度的变化曲线Fig.1 Change curves of absorbance of 0.5 mg·mL-1 glycosylation polymer solution(a) and 0.1 mg·mL-1 AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution(b) with temperature

由图1a可知,糖基聚合物的LCST为40.3 ℃。当温度较低时,DEGMA的醚键结构与水分子间的氢键作用力相持平,糖基聚合物呈水溶性状态,溶液表现为澄清透明;当温度逐渐升高时,DEGMA中的醚键结构与水分子间的氢键作用逐渐被破坏,糖基聚合物由亲水状态逐渐转变为疏水状态,溶液逐渐变为不透明乳白色;当温度降低时,溶液又能变回澄清透明,表明糖基聚合物的相转变过程是可逆的,具有良好的温敏性。

由图1b可知,糖基化金纳米笼复合物的LCST为42.6 ℃。当温度较低时,糖基化金纳米笼复合物溶液呈澄清透明的浅蓝色;当温度逐渐升高时,糖基化金纳米笼复合物由亲水状态转变为疏水状态,使其溶解度降低,溶液逐渐变成浑浊半透明状态,故糖基化金纳米笼复合物表现出与糖基聚合物相似的温敏性。

2.3 紫外可见吸收光谱分析(图2)

图2 Au浓度相同的金纳米笼溶液和糖基化金纳米笼复合物溶液的紫外可见吸收光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectra of AuNCs solution and AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with same Au concentration

由图2可知,金纳米笼和糖基化金纳米笼复合物在波长700 nm左右有较明显的LSPR吸收峰,两者的吸收峰型相似,表明在金纳米笼表面接枝聚合物没有改变本身的结构和性质。相较于金纳米笼,糖基化金纳米笼复合物的吸收峰强度变弱,这是由于,糖基聚合物包裹在金纳米笼表面,使材料的光敏感度和光响应度降低,从而使吸光度下降,证明糖基聚合物成功接枝到金纳米笼表面。

2.4 TEM分析(图3)

图3 金纳米笼(a)和糖基化金纳米笼复合物(b～d)的TEM照片Fig.3 TEM images of AuNCs(a) and AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu)(b-d)

由图3可知,金纳米笼的粒径为50 nm;经糖基聚合物修饰后金纳米笼的分散性较好,糖基化金纳米笼复合物的粒径在60 nm左右,且仍具有中空多孔的形态。金纳米笼表面有一层淡淡的晕,进一步证明糖基聚合物成功接枝到金纳米笼表面。

2.5 糖基化金纳米笼复合物的光热转换作用(图4)

图4 Au浓度为20 μg·mL-1的糖基化金纳米笼复合物溶液在不同强度的808 nm激光照射300 s的体系(a)、不同Au浓度的糖基化金纳米笼复合物溶液在808 nm激光(强度1.0 W·cm-2)照射300 s的体系(b)、Au浓度为20 μg·mL-1的糖基化金纳米笼复合物溶液在808 nm激光(强度1.0 W·cm-2)照射300 s后自然冷却至室温的体系(c)的温度变化曲线及Au浓度为20 μg·mL-1的糖基化金纳米笼复合物溶液在冷却过程中-lnθ-t的关系曲线(d)Fig.4 Temperature change curves of AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 irradiated for 300 s by 808 nm laser with different intensities(a),AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with different Au concentrations irradiated for 300 s by 808 nm laser(intensity of 1.0 W·cm-2)(b),AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 naturally cooling to room temperature after 300 s irradiation by 808 nm laser(intensity of 1.0 W·cm-2)(c),and -lnθ-t relationship curve of AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 during cooling process

由图4a可知,当Au浓度为20 μg·mL-1的糖基化金纳米笼复合物溶液在强度分别为0.8 W·cm-2、1.0 W·cm-2、1.2 W·cm-2、1.4 W·cm-2和1.6 W·cm-2的808 nm激光照射300 s后,溶液温度分别为28.0 ℃、34.6 ℃、36.0 ℃、40.2 ℃和44.2 ℃,即激光强度越强,溶液升温越快。表明金纳米笼接枝糖基聚合物后仍具有较好的光热性能。由图4b可知,当Au浓度分别为4 μg·mL-1、8 μg·mL-1、12 μg·mL-1、16 μg·mL-1和20 μg·mL-1的糖基化金纳米笼复合物溶液在808 nm激光(强度1.0 W·cm-2)照射300 s后,溶液温度分别为26.0 ℃、27.7 ℃、30.2 ℃、33.1 ℃和34.6 ℃,即Au浓度越大,溶液升温越快。表明糖基化金纳米笼复合物的光热转换效率取决于激光强度及Au浓度,溶液的最终温度与激光强度及Au浓度呈正相关。

超纯水对照组的温差ΔT=0.4 ℃,由于水的比热容C为4.2×103J·kg-1·℃-1,计算得到Qdis=0.112 mW;由拟合曲线计算得到τ为69.24 s(图4d)。

由于糖基化金纳米笼复合物溶解在0.2 mL水中,根据式(2)计算得到hS=12.13 mW·℃-1。由式(3)计算得到Au浓度为20 μg·L-1的糖基化金纳米笼复合物在808 nm激光(强度1.0 W·cm-2)照射下(A808=0.137)的光热转换效率为43.01%。

2.6 糖基化金纳米笼复合物的光热稳定性(图5)

图5 Au浓度为20 μg·mL-1的糖基化金纳米笼复合物溶液在808 nm激光(强度1.0 W·cm-2)照射下的光热稳定性Fig.5 Photothermal stability of AuNCs@P(DEGMA-co-OVNGlu) solution with Au concentration of 20 μg·mL-1 after irradiation by 808 nm laser(intensity of 1.0 W·cm-2)

由图5可知,当循环次数增加时,体系最高温度逐渐升高,在4次循环中,体系最高温度分别达到34.6 ℃、34.9 ℃、35.1 ℃和35.3 ℃。这是因为,升温会导致溶液水分挥发,增加Au浓度,而激光强度不变,则体系最高温度升高。说明糖基化金纳米笼复合物仍具有良好的光热稳定性。

2.7 糖基化金纳米笼复合物与凝集素ConA的特异性识别作用

利用紫外浊度法分析糖基化金纳米笼复合物识别ConA后溶液的吸光度变化,发现加入ConA后约20 min,溶液的吸光度趋于稳定,最终透光率达到57%。说明糖基聚合物接枝到金纳米笼表面并没有改变糖基聚合物对凝集素ConA的特异性识别能力。另外,糖基化金纳米笼复合物与凝集素ConA识别后粒径由62.8 nm增大到80.2 nm,表明糖基化金纳米笼复合物与ConA发生了识别。

3 结论

通过酶促可逆加成-断裂链转移聚合-原位还原法制备了温敏性糖基化金纳米笼复合物。紫外可见吸收光谱表明,糖基化金纳米笼复合物具有良好的温敏性,其LCST为42.6 ℃;经激光照射后,糖基化金纳米笼复合物溶液升温快,光热转换效率高,达到43.01%;糖基化金纳米笼复合物保留了对凝集素ConA的特异性识别作用,表明糖基化金纳米笼载药体系对肿瘤靶向治疗具有潜在的应用价值。