中药五倍子对牙体硬组织及树脂材料表面变异链球菌的抑菌作用研究

李 娜，吴昊泽，范晓敏，仇 珺，梅笑寒，余 擎，程小刚(口颌系统重建与再生全国重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔疾病临床医学研究中心，空军军医大学口腔医学院牙体牙髓病科，陕西 西安 710032)

龋病是在口腔环境多种因素影响下，牙齿硬组织所发生的一种慢性进行性病损，是人类的常见病和多发病。随着饮食的日臻精致，其发病率也不断上升。变异链球菌、口链球菌、粘性放线菌等是引起龋病发生的主要病原菌，其中变异链球菌与龋病的发生发展有着密切的联系[1]。变异链球菌是龋病的首要致龋菌之一，它致龋需要依赖于形成菌斑生物膜这种特殊的结构。

许多中草药都具有一定的抗菌性能，如五倍子、黄芪、艾叶、陈皮、蒲公英等，其毒副作用甚微[2]。五倍子为蛋倍蚜等倍蚜科昆虫寄生在青麸或红麸杨等漆树科植物上形成的虫瘿，别名文蛤、百虫仓、木附子等，因其所形成虫瘿的蚜虫头部触角为五节，便形象地称之为五倍子[3]。其用药已有约1 400年的历史，具有广泛的药理特性，如防龋、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[4]。五倍子的有效抗菌成分主要是一类水解性的植物单宁——五倍子单宁[5]。它是一种复杂化合物，对大肠杆菌等细菌有着显著的抗菌作用，其机制可能与单宁酸对蛋白有凝固作用有关，从而影响细菌的生长代谢[6]。

以往，在口腔领域应用较多的抗菌防龋药物有氯已定、氟化钠等。氯已定又名洗必泰，是一种有机化合物，其作为阳离子型的广谱杀菌剂，具有较强的抑菌、杀菌作用[7]，但长期使用会引起着色、味苦及口腔菌群紊乱等诸多不良反应，这些缺点在一定程度上限制了其临床应用。五倍子作为中药防龋药物前期已有研究，实验结果显示其对相关口腔致病菌具有一定的抗菌作用[8-9]。本研究主要选取牙体硬组织磨片及临床中常用的牙科材料，通过电镜和激光共聚焦观察五倍子对变异链球菌的作用及对菌斑生物膜形成的影响，从而对其在临床防龋方面的功效进行研究，为其可能作为中药防龋应用于临床提供进一步的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)；厌氧培养箱(YQX-Ⅱ型，上海博泰)；离子溅镀系统(Ion Sputter E-1045，Hitachi，日本)；激光共聚焦显微镜(CLSM Fluo View 1000，奥林巴斯，日本)；干燥机(ES-2030，Hitachi，日本)；冷场发射电镜(S-4800，Hitachi，日本)；超纯水器(Milli-QUF Plus，Millipore，美国)；电子天平(Sartorius，德国)；24孔板(Corning，美国)；移液器(Eppendorf公司，美国)；变异链球菌UA159(空军军医大学口腔医院实验室提供)；洗必泰(Sigma公司，美国)；五倍子(空军军医大学口腔医院药剂科提供)；纳米树脂(Z350，3M ESPE，美国)；氯已定(Sigma公司，美国)；LIVE/DEAD®BacLightTM染色剂(Invitrogen Inc，美国)；脑心浸液琼脂(brain heart infusion agar，BHI)培养基(Difco公司，美国)；琼脂粉(Sigma公司，美国)；无水乙醇(Sigma公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 变异链球菌的培养 菌种的复苏：将在-80 ℃冻存的变异链球菌菌种解冻后，接种于备好的BHI培养基上，在37 ℃恒温厌氧箱中(850 mL/L N2，100 mL/L H2，50 mL/L CO2)培养24 h待用。

菌悬液的制备：将培养基上的单克隆菌株挑取后放入含有5 mL BHI培养液的试管内，继续于37 ℃恒温厌氧箱中培养24 h后待用。

1.2.2 牙体硬组织及树脂材料试件的制作 牙体硬组织的制作是采用慢速切割机将离体牙制成厚度约1 mm的牙釉质磨片和牙本质磨片，高温高压消毒后备用；牙本质与树脂相交界面的制作方法为在离体牙的合面用快速手机磨出直径约5 mm且厚度约3 mm的Ⅰ类洞型，消毒干燥后涂布粘接剂光照，随后用光固化纳米树脂进行分层充填固化，再用慢速切割机切成厚度约2 mm的试件，高温高压消毒后备用；树脂材料试件的制作是将光固化纳米树脂用载玻片压制为厚度约1 mm的圆形薄片后光照固化40 s，放置在含950 mL/L乙醇溶液中浸泡消毒，并在紫外线灯照射30 min后备用。

1.2.3 牙体硬组织及与树脂材料界面上变异链球菌的培养 将牙釉质磨片、牙本质磨片及牙本质与树脂相交界面的试件分别用无菌镊子夹入24孔板中，实验分为4组，根据李娜等[10]前期的实验研究，五倍子组浓度设定为8 g/L(8 g/L五倍子组)和16 g/L(16 g/L五倍子组)，另两组为空白对照组和2 mL/L洗必泰的阳性对照组(2 mL/L洗必泰组)，磨片和试件每组均为9个。将培养好的变异链球菌浓度调至105CFU/mL后，分别在各孔中加入200 μL菌液后静置30 min，各组再分别加入1 mL BHI培养液、含五倍子终末浓度为8 g/L的BHI培养液、含五倍子终末浓度为16 g/L的BHI培养液及2 mL/L洗必泰的BHI培养液，随后放置于37 ℃的恒温厌氧箱中培养12 h，培养结束取出后吸出培养液，用三蒸水进行轻柔洗涤，将配置好的25 mL/L戊二醛加入各孔中固定24 h，采用不同浓度的乙醇溶液进行梯度脱水，干燥喷金后使用扫描电镜观察各组变异链球菌的形态及生物膜的形成。

1.2.4 树脂材料表面上变异链球菌的培养 将树脂试件磨片用无菌镊子夹入24孔板中，将培养好的变异链球菌浓度调至108CFU/L后，分别在各孔中加入200 μL菌液，静置30 min后放入厌氧培养箱中培养12 h，培养结束取出后吸出培养液，用三蒸水进行轻柔洗涤，然后在各孔中分别加入1 mL BHI液、8 g/L五倍子液、16 g/L五倍子液及2 mL/L洗必泰，让各组与生物膜作用10 min，轻柔洗涤后各孔中分别加入200 μL新鲜配制的LIVE/DEAD染色剂，染色20 min后再用三蒸水轻柔洗涤3次，通过激光共聚焦显微镜观察各组死菌和活菌染色情况并计算活菌百分比。

2 结果

2.1 牙体硬组织表面的电镜观察

通过扫描电镜观察牙釉质和牙本质表面，空白对照组变异链球菌形成了串珠样结构且有菌斑生物膜的形成，五倍子组未形成较致密的菌斑生物膜，且变异链球菌形态有一定的改变，形态学观察不同浓度(8，16 g/L)五倍子组间无明显区别，2 mL/L洗必泰组未形成菌斑生物膜并可见部分细菌破碎；各实验组在牙釉质与牙本质表面细菌形态表现相类似(图1)。

图1 牙釉质及牙本质上各组形成变异链球菌生物膜形态(扫描电镜观察，×5 000)

2.2 牙本质与树脂界面的电镜观察

图2所示上方均为树脂材料，下方为牙本质，在牙本质与树脂相交界面处，空白对照组形成了致密的菌斑生物膜，尤其在界面处较为聚集，两组五倍子组界面处未形成菌斑生物膜，可见散在的细菌存在，2 mL/L洗必泰组界面处亦无生物膜的形成，仅有少量破碎细菌散在。

A：空白对照组；B：8 g/L五倍子组；C：16 g/L五倍子组；D：2 mL/L洗必泰组。扫描电镜观察(×1 000)。图2 牙本质与树脂材料相交界面处各组形成变异链球菌生物膜的形态

2.3 树脂表面的激光共聚焦观察

树脂材料表面细菌生物膜经各实验组处理后，空白对照组中视野内大多为绿色荧光，活菌百分比最高；8 g/L五倍子组红色荧光增多，相比空白对照组死菌的数量增多，活菌百分比降低；16 g/L五倍子组绿色荧光较8 g/L五倍子组减少，视野内大多红色荧光，活菌百分比较低；2 mL/L洗必泰的阳性对照组几乎全为红色荧光，仅有少量活菌(图3)。用ImageJ软件进行荧光强度分析后计算出各实验组的活菌百分比，空白对照组(78.33±13.71)%，8 g/L五倍子组(45.89±12.84)%，16 g/L五倍子组(20.33±6.34)%，2 mL/L洗必泰组(7.67±4.03)%，经统计软件分析后每两组比较，其活菌百分比均有统计学差异(P<0.05)。

A：空白对照组；B：8 g/L五倍子组；C：16 g/L五倍子组；D：2 mL/L洗必泰组。激光共聚焦显微镜观察(×600)。图3 树脂材料表面各组处理后死菌活菌染色菌斑生物膜

3 讨论

中医理论注重整体平衡，在抑制细菌的同时，不对机体形成较大的毒副作用，主张祛邪扶正，从而自主提高机体抵抗力。中药历史悠久，是我们中华民族的瑰宝，中药防龋是基于中医理论提出的[11]。我国中药防龋方面的研究已有数十年，从资源较丰富的中草药中对有防龋能力的药物进行了大量的研究[12]。

龋齿形成的主要原因是口腔内多种细菌在牙齿表面附着并形成了菌斑生物膜，其中变异链球菌与龋病的发生发展密切相关[13]，对龋病的发生发展起着重要的作用，变异链球菌以食物为底物，可通过细菌分解产酸、黏附等作用，使牙菌斑内的pH值降低后局部脱矿，使牙体组织的结构破损后形成龋坏。因此，通过药物作用抑制变异链球菌的生长繁殖、黏附和产酸等，发挥防龋的作用，从而降低龋病发生率，因此变异链球菌仍是人们对龋病研究的重点之一。

龋齿治疗除了Carisolv凝胶结合手术显微镜的微创化学去腐方案外[14]，临床上常规用树脂进行充填，充填后牙面与充填物相交的界面处易有大量致龋菌，继发龋的发生往往是由于充填物的边缘与窝洞周围的牙体组织相交处不密合或者微渗漏导致的，实验中观察充填后牙体与树脂界面处的菌斑生物膜，不同浓度的五倍子和洗必泰均能有效减少界面处菌斑生物膜的形成，可能是五倍子的收敛作用有效减少了菌斑生物膜的形成。激光共聚焦显微镜观察结果显示材料表面经五倍子处理后，不仅破坏了菌斑生物膜的完整性，还可杀灭细菌，随着五倍子浓度的增大其活菌百分比越低。随着药物作用时间的延长，五倍子是否对细菌会有持续的作用效果，这部分内容需进一步研究。

五倍子在口腔中的应用较广，主要有防龋和促进再矿化两方面的作用。研究显示五倍子可作为牙本质再矿化的有效替代方法[15]，五倍子在动物模型中可促进牙釉质的龋损再矿化[16]；在防龋方面的研究显示五倍子的粗提物和提纯的一些主要成分有显著的防龋功效[17]。本研究电镜观察到五倍子组的变异链球菌形态发生了改变，且细菌体积稍大，可能是细菌在生长繁殖过程中受到了五倍子有效成分的影响，使细菌的基因调控或表达发生了改变，进而影响了细菌形态，可能的机制是五倍子提取液能抑制变链菌生长，并降低葡糖基转移酶的活性，从而减少了细菌的黏附，进而减少了黏附在早期菌斑生物膜表面细菌的数量[18-19]，但具体的作用机制仍有待进一步实验研究。

综上所述，天然药物五倍子在我国盛产，其资源丰富且取材方便，已有广泛的临床应用基础，在口腔领域的研究具有抗菌防龋等特点，有着较好的应用前景。