肾细胞癌中免疫细胞浸润与患者预后的相关性分析

曹 嫄，李 宇，张克英，卢 通，韩东晖，李程彬，何伟翔，赵晓龙，徐志成，秦卫军，杨力军(空军军医大学西京医院：门诊部，泌尿外科，陕西 西安 7003)

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)占所有恶性肿瘤的3%～5%，发病率居第16位，死亡率居第17位[1]。早期RCC患者主要以根治性手术治疗为主且预后较好，而进展期RCC预后较差且缺乏有效的治疗方法[2]。研究表明，RCC的进展与肿瘤免疫微环境密切相关，且总体免疫细胞浸润更丰富的患者预后更好[3]。然而，免疫细胞类型多样，不同免疫细胞在肿瘤恶性进展中的作用存在差异[4]。阐明具体的免疫细胞类型与肿瘤预后的相关性，并进一步指导临床决策意义重大。为此，本研究利用生物信息学方法，对检索自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库的RCC数据进行免疫细胞浸润量化和预后分析，以揭示免疫微环境与RCC恶性进展的相关性，为RCC预后预测和临床决策提供可靠的评价指标。

1 对象与方法

1.1 对象

895例RCC患者基因表达数据和相应患者的临床信息，检索自TCGA数据库，包括肾透明细胞癌、肾乳头状癌和肾嫌色细胞癌。临床信息包括：生存时间、生存状态、年龄、性别、病理分期、TNM分期等。通过Perl软件将单个条目的TCGA数据整合成数据矩阵。利用R软件的limma程序包将重复测量的基因数据取均值并替换，得到基因表达矩阵。

1.2 方法

1.2.1 基于CIBERSORT算法的免疫细胞量化 利用R软件的CIBERSORT程序包和LM22特征基因表达矩阵，对上述RCC基因表达矩阵进行分析，量化得到每个患者肿瘤组织中22种免疫细胞的肿瘤浸润分数。根据每种免疫细胞肿瘤浸润分数的范围，以中位数值作为截断值，将患者分为该免疫细胞的高浸润组和低浸润组。将CIBERSORT算法循环运行100次以提高量化分析的准确性。以P<0.05为阈值，筛选量化合格的患者，绘制免疫细胞占比柱状图，并进行后续分析。根据上述分析策略，我们分别构建了3种分组策略：静息树突状细胞高浸润组(285人)和低浸润组(286人)；静息肥大细胞高浸润组(286人)和低浸润组(286人)；活化型CD4+记忆性T细胞高浸润组(285人)和低浸润组(284人)。

1.2.2 免疫细胞浸润与RCC预后的相关性分析 利用R软件基于患者ID号，将上述免疫细胞量化结果与临床信息逐一匹配。利用R软件的survival程序包分析不同类型的免疫细胞肿瘤浸润程度与RCC患者生存时长的相关性，并通过Kaplan-Meier生存曲线进行可视化分析。

1.2.3 免疫细胞浸润与RCC临床特征的相关性分析 利用R软件beeswarm程序包的Wilcoxon秩和检验，分析不同类型的免疫细胞肿瘤浸润程度与RCC临床特征，如病理分期、TNM分期等肿瘤恶性程度指标的相关性。利用R软件的barplot函数绘制小提琴图。

2 结果

2.1 树突状细胞、肥大细胞、活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润程度与患者生存相关

比较RCC组织中各类免疫细胞肿瘤浸润程度较癌旁组织的差异发现，树突状细胞、肥大细胞、活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润程度显著增高(图1A)。进一步的生存分析结果提示，树突状细胞和肥大细胞的肿瘤浸润程度与患者预后呈正相关(图1B～C)，而活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润程度则与患者预后呈负相关(图1D)。

A：肾透明细胞癌及正常样本中各种免疫细胞占比的柱状图；B～D：分别为静息树突状细胞、静息肥大细胞、活化型CD4+记忆性T细胞构成水平的Kaplan-Meier生存曲线，3组生存曲线的P值均<0.05。图1 静息树突状细胞、静息肥大细胞、活化型CD4+记忆性T细胞的浸润程度与患者生存率相关

2.2 静息树突状细胞的浸润程度与肿瘤分期和分级均呈负相关

对静息树突状细胞的肿瘤浸润程度与RCC患者的临床病理参数进行相关性分析，结果提示：临床分期越高，静息树突状细胞的肿瘤浸润程度越低，即高浸润静息树突状细胞的RCC患者肿瘤主要为T1～T2期，而低浸润主要为T3～T4期(图2A)。与之相一致的，病理分级越高，静息树突状细胞的肿瘤浸润程度越低，即高浸润的病理分级主要为Ⅰ和Ⅱ级，低浸润主要为Ⅲ和Ⅳ级(图2B)。

A：T1～T4期RCC患者的静息树突状细胞的肿瘤浸润量；B：Ⅰ～Ⅳ级RCC患者的静息树突状细胞的肿瘤浸润量。 aP<0.05。图2 静息树突状细胞的浸润程度与肿瘤分期和分级均呈负相关

2.3 静息肥大细胞的肿瘤浸润程度与肿瘤分期和分级均呈负相关

对静息肥大细胞的肿瘤浸润程度与RCC患者的临床病理参数进行相关性分析，结果提示：肿瘤分期和分级评分越高，静息肥大细胞的肿瘤浸润程度越低，即从G1到G4期静息肥大细胞肿瘤浸润量逐渐下降(P<0.05，图3A)。与之相一致的，病理分级越高，静息肥大细胞的肿瘤浸润程度越低，即从Ⅰ级到Ⅳ级静息肥大细胞肿瘤浸润量逐渐下降(P<0.05，图3B)。静息肥大细胞的肿瘤浸润量与T分期、M分期具有相同的负相关关系(P<0.05，图3C～D)。

A：G1～G4期RCC患者的静息肥大细胞的肿瘤浸润量；B：Ⅰ～Ⅳ级RCC患者的静息肥大细胞的肿瘤浸润量；C：T1～T4期RCC患者的静息肥大细胞的肿瘤浸润量；D：M0～M1期RCC患者的静息肥大细胞的肿瘤浸润量。aP<0.05。图3 静息肥大细胞的浸润程度与肿瘤分期和分级均呈负相关

2.4 活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润程度与肿瘤分期和分级均呈正相关

对活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润程度与RCC患者的临床病理参数进行相关性分析，结果提示：肿瘤分期和分级评分越高，CD4+活化记忆T细胞肿瘤浸润程度越高，即从G1到G4期活化型CD4+记忆性T细胞肿瘤浸润量逐渐升高(图4A)。与之相一致的，病理分级越高，活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润程度越高，即从Ⅰ级到Ⅳ级活化型CD4+记忆性T细胞肿瘤浸润量逐渐升高(图4B)。活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润量与TNM分期具有相同的正相关关系(图4C～E)。

A：G1～G4期RCC患者的活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润量；B：Ⅰ～Ⅳ期RCC患者的活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润量；C：T1～T4期RCC患者的活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润量；D：N0～N1期RCC患者的活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润量；E：M0～M1期RCC患者的活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润量。 aP<0.05。图4 活化型CD4+记忆性T细胞的肿瘤浸润程度与肿瘤分期和分级均呈正相关

3 讨论

RCC是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，复发率和转移率均较高且进展期预后较差[5]。为了在疾病早期筛选出肿瘤进展高风险的患者，需要找出具有临床意义的预后指标，从而对于此类患者进行更好的监测和管理。目前临床常用的仍是基于患者的影像学资料进行临床分期，根据术后病理检查进行病理分级[6]。然而RCC患者的个体差异大，即使是同一肿瘤的内部也表现出显著的区域性差异，因此我们需要更多更精细化的预后指标来指导临床工作[7]。

近年来，肿瘤免疫微环境的研究被广泛展开，RCC的肿瘤免疫微环境与肿瘤进展密切相关[8]。本研究对肾细胞癌中免疫细胞的肿瘤浸润特点进行了分析。结果显示，树突状细胞、肥大细胞、活化的CD4+记忆性T细胞肿瘤浸润量与RCC患者的预后和临床分级分期具有相关性，且这三种免疫细胞在肾细胞癌的进展中发挥着完全不同的作用。肿瘤免疫微环境中的细胞串扰一直备受研究者的关注[9]，本研究不仅为RCC的早期筛查和风险评估提供参考，同时将为肾细胞肿瘤免疫微环境的研究提供新的思路。

树突状细胞主要发挥抗原呈递的作用。在肿瘤微环境中，存在各种作用于树突状细胞的抑制性细胞因子，导致树突状细胞功能异常，进而使肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视[10]。因此树突状细胞的免疫浸润增多有助于人体获得性免疫系统的激活，产生更强的抗肿瘤作用，这解释了本研究关于高浸润树突状细胞与预后呈正相关的发现。

肥大细胞是固有免疫细胞的重要组成部分[11]。研究表明瘤内肥大细胞在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)的癌巢基质细胞中占有优势，并与NSCLC患者生存率相关[12]。人体内肥大细胞具有两种表型，其中一种含有类胰蛋白酶，而另一种包含类胰蛋白酶及糜酶。类胰蛋白酶主要位于黏膜上皮及固有层中，而类胰蛋白酶及糜酶主要位于皮肤及结缔组织中。瘤内的此两种表型对于NSCLC的生存率均有改善，提示肥大细胞能参与到抗肿瘤免疫过程中。肥大细胞可通过分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)促进T淋巴细胞增殖，而通过TNF促进生长的T淋巴细胞又可正反馈促进肥大细胞增殖，两者共同发挥抗肿瘤作用。另外，肥大细胞可通过脱颗粒释放蛋白酶破坏肿瘤基质，肿瘤细胞外基质及细胞结构受到破坏，从而抑制肿瘤的生长浸润[13]。

受到抗原刺激后，CD4+T细胞主要识别外源性抗原肽并分化为调节性T细胞[14]。本研究发现活化的CD4+记忆性T细胞所占比例随着临床分期的增加呈上升趋势，表明随着疾病进展，患者的免疫功能在不断恶化，机体对肿瘤细胞的杀伤作用也在逐渐减弱。调节性T细胞在高分化、中分化和低分化患者中的表达水平有显著差异，提示机体对低分化的肿瘤细胞杀伤作用弱，对高分化的肿瘤细胞杀伤作用强[15]。

本研究通过生物信息学分析方法，分析22种肿瘤浸润淋巴细胞亚群与临床的分级分期和预后具有重要关联，这些关联能够帮助筛选出肿瘤进展高风险的RCC患者，并给予早期干预和临床指导。3种与预后密切相关的免疫细胞，不仅提供诊断和预测价值，同时可能是良好的治疗靶点。本研究进一步揭示构成肿瘤微环境的临床和生物学意义，但是对于RCC的具体作用机制及临床预后价值的探讨仍需进一步研究证实。