ICP-MS法测定砷脂摄入对小鼠砷蓄积及矿物元素水平的影响

陈佳佳,钟映雄,汪卓,李瑞,贾学静,陈建平,刘晓菲,宋兵兵,钟赛意,2,3*

(1.广东海洋大学食品科技学院,广东 湛江 524088;2.广东海洋大学深圳研究院,广东 深圳 518108;3.大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心,辽宁 大连 116034)

砷,是一种非金属元素,在自然界中广泛存在,被国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)确定为致癌物。砷中毒会对皮肤、神经、免疫和生殖系统造成损伤[1]。砷可分为无机砷和有机砷,砷脂是存在于微生物、植物、鱼类组织中的一类中性脂质类似物[2],属于有机砷。不同海洋生物中砷化合物的形态丰度各不相同,如紫菜中检测出了无机三价砷、无机五价砷、砷甜菜碱、砷胆碱和砷糖5种砷形态,其中砷糖含量最高,占总砷含量的66.9%[3]。砷脂在海洋生物中含量较高,藻类、真菌和贝类的砷脂含量占总砷含量的4.2%～46.0%[4-5];鱼类中的砷脂含量约占总砷含量的35%[6],某些鱼类的肝脏部位[7]以及鱼油[8-9]中的砷脂含量更高,前者占总砷含量的62.3%,后者占总砷含量的70%及以上。因此,饮食途径是人们砷脂暴露的主要来源。

砷的毒性与砷形态及其在体内的生物转化行为息息相关,对海产品的质量安全有重要影响[10]。一般来说,无机砷毒性大于有机砷,通常认为砷脂毒性极低,或者直接认为其无毒[11-13],中国食品安全评价以总砷含量或无机砷含量为指标,对砷脂不予关注。但近年来随着技术发展,砷脂已被证明在人体内蓄积,对人体具有细胞毒性,某些砷脂在μmoL级别甚至可以穿越血脑屏障造成神经毒性[14-16],会对人体健康造成潜在危害,人们对砷脂可能含有的毒性感兴趣。肝脏和肾脏是砷化合物在体内代谢、蓄积和慢性毒作用的主要靶器官,因而其组织结构和功能极易受到损伤[17-18]。通常,生物体内的矿物元素处于一种平衡状态,这些元素在生长发育、新陈代谢、免疫调节和其他生理活动中发挥着不可替代的作用[19-24]。研究表明,氧化应激是砷肝毒性的关键致病机制[25-27]。体内矿物元素失衡可能会诱发氧化应激并导致肝病[28-30]。

常见的元素分析方法有原子吸收法[31]和原子荧光法[32]等,原子吸收法是利用被测元素原子蒸气中的基态原子对该元素的共振线的吸收来进行测定的。原子荧光法的原理是基态原子吸收合适的特定频率的辐射而被激发到高能态,在激发过程中以光辐射的形式发射出特征波长的荧光。这些方法局限性在于单元素检测,易受到光谱干扰和检测效率低。电感耦合等离子体质谱(Iductively coupled-plasma mass spectrometry,ICP-MS)是一种多元素同步分析方法[33],灵敏度高,能够跟踪多元素同位素信号变化等[34],且检出限低,对于结构复杂、生物细胞中痕量的砷化合物来说是最可靠的形态分析方法[35-36]。因此,本研究利用ICP-MS多元素同时在线检测和灵敏度高的优点来对小鼠组织中的矿物元素进行检测,为初步判断海产品中砷脂的摄入对小鼠的肝肾组织造成的影响提供技术手段,为后续砷脂的毒理学相关内容提供实验基础,也为海产品风险评估提供有效实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

C57BL/6J小鼠(6周龄,SPF级),斯贝福(北京)生物技术有限公司;硝酸(优级纯),30%过氧化氢(优级纯),国药集团化学试剂有限公司;调谐液、内标液,美国Agilent公司;多元素混合标准溶液,国家标准物质研究中心;无水硫酸钠(分析纯)、二氯甲烷(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)、甲醇(分析纯)、乙醇(分析纯),广东光华科技股份有限公司;浓盐酸(分析纯)、乙醚(分析纯)、硅胶(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;1-溴十五烷(>98%)、1-溴十六烷(97%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1-溴十八烷(≥97%)、二甲基胂酸(≥98%)、亚硫酸氢钠[≥58.5%(SO2)]、碘化钾(99%)、氢氧化钠(分析纯),氘代甲醇、氘代氯仿,美国Sigma-Aldrich公司。3种砷脂(AsHC 332、AsHC 346和AsHC 374,数字为砷脂相对分子质量)的合成参考Taleshi等[37]文献,主要通过以下三步法合成砷脂,1)以二甲基胂酸与亚硫酸氢钠、盐酸和碘化钾为原料,发生还原反应和取代反应得到碘化二甲胂;2)碘化二甲胂与氢氧化钠在一定条件下发生取代反应得到双(二甲基胂)氧化物;3)双(二甲基胂)氧化物在一定条件下先发生氧化分解,再与溴代烷烃发生取代反应加入碳链,从而合成对应砷脂,再经过硅胶柱分离纯化,并利用核磁共振、高分辨率质谱和电感耦合等离子体质谱对其鉴定。砷脂分子量大小取决于溴代烷烃的侧链长度。通过上述三步化学法合成AsHC 332、AsHC 346和AsHC 374三种砷脂,结构式如图1所示。合成的砷脂先用无水乙醇溶解至中间浓度,再用生理盐水稀释至乙醇浓度为1%,已有文献表明1%无水乙醇不会对小鼠引发任何毒性作用[38]。

图1 AsHC 332、AsHC 346和AsHC 374 3种砷脂结构式Fig.1 Molecular structure of AsHC 332、AsHC 346 and AsHC 374 synthesized in this work

1.2 仪器与设备

Agilent 7500cx型ICP-MS,美国安捷伦公司;Multiwave PRO 41HVT56型微波消解仪,奥地利安东帕公司;Avance NEO 400MHz核磁共振仪,美国Agilent公司;qtof6550型高分辨率质谱,德国Bruker公司;DF-101S加深款集热式磁力搅拌器,上海力辰邦西仪器科技有限公司;EYELA N-1300系列旋转蒸发仪,日本EYELA公司;MGS-2200H氮吹仪,杭州瑞诚仪器有限公司;DZF-6050 真空干燥箱,上海一恒科学有限公司;AUW120型电子天平,日本岛津公司;超纯水设备,日本Panasonic公司。

1.3 实验方法

1.3.1 试验动物的分组与操作

40只6周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供实验动物质量合格证[许可证号：SCXK(京)2019-0010],在室温(25±1)℃,相对湿度(55±5)%,12 h昼夜交替的环境下自由给水进食,对水瓶、笼子、垫料等喂养所需材料进行高压蒸汽灭菌,并隔天更换。小鼠经适应性喂养1周后被随机分成溶剂对照组和3个实验组,每组10只。溶剂对照组灌胃1%乙醇的生理盐水,实验组分别灌胃AsHC 332、AsHC 346和AsHC 374,灌胃剂量均为3 mg/kg,每次灌胃体积10 μL/g,灌胃4周,每周记录小鼠的体重。灌胃结束,乙醚麻醉,取小鼠内脏,用生理盐水清洗并称重记录,根据公式(1)计算得脏器系数。整个实验过程符合实验伦理学要求,尽可能减少动物的使用量,减少动物的应激、痛苦和伤害。

脏器系数(%)=mx/m28×100%

式(1)

其中,mx为心、肝、脾、肺、肾等脏器的质量,m28为灌胃28 d后小鼠的体重。

1.3.2 样品前处理

准确称取小鼠脏器0.2～0.3 g(精确至0.000 1 g)于微波消解罐中,加入6 mL浓硝酸和0.5 mL 30%过氧化氢溶液。将消解罐放入微波消解仪中,按照表1进行消解。消解完毕,赶酸,冷却定容至50 mL,准备ICP-MS上机测砷(As)含量。对肝脏和肾脏这两个代谢的主要靶器官测钾(K)、钠(Na)、钙(Ca)、镁(Mg)、锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、钴(Co)、铬(Cr)、镍(Ni)和硒(Se)12种矿物元素的含量。

表1 微波消解程序Tab.1 The parameter information of microwave digestion

1.3.3 ICP-MS分析

ICP-MS开机后,使用调谐液在线优化各项参数,使分辨率和灵敏度等各项仪器状态达到最佳,最佳工作参数为：射频功率1 550 W、发射功率1 W、雾化室温度2 ℃、等离子体气流量15 L/min和载气流量1 L/min。元素含量测定过程中加入内标元素校正仪器响应信号的变化。将多元素一系列标准溶液按低到高浓度依次上机,测定相应浓度的信号值。以标准溶液质量浓度为横坐标、信号强度为纵坐标绘制标准曲线,根据标准曲线采用外标法定量。实验过程中,设计平行样、加标回收率及精密度试验以确保检测数据的准确性。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 3种砷脂对小鼠体重及脏器系数的影响

由表2可知,灌胃前砷脂处理组和溶剂对照组的小鼠体重并无显著性差异。与灌胃前小鼠体重相比,灌胃28 d后小鼠体重显著增加(P<0.05),但砷脂处理组与溶剂对照组的小鼠体重并无显著性差异(P>0.05)。此外,从小鼠心、肝、脾、肺和肾的脏器系数来看,砷脂处理组和溶剂对照组内脏的脏器系数并无显著性差异(P>0.05)。由此可得,短期砷脂暴露并不会对小鼠的正常生长发育造成影响。

表2 3种砷脂对小鼠体重及脏器系数的影响Tab.2 Effects of three arsenolipids on body weight and organ coefficients in mice

2.2 3种砷脂在小鼠脏器中的砷蓄积情况

由图2可知,与溶剂对照组相比,3种砷脂的摄入均会在小鼠的心、肝、脾、肺和肾脏中造成明显的砷蓄积,但蓄积趋势并不一致。3种砷脂AsHC 332中在肾脏和肝脏的砷蓄积作用强于AsHC 346和AsHC 374,而对心、肺和脾来说,3种砷脂中AsHC 374的砷蓄积作用强于AsHC 332和AsHC 346。这可能与AsHC 332、AsHC 346和AsHC 374的结构不同、分子量不同,毒作用的靶器官不同有关。

图2 3种砷脂在小鼠心、肝、脾、肺和肾脏中的砷蓄积情况注：AsHC 332组、AsHC 346组和AsHC 374组与溶剂对照组进行比较;其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。Fig.2 Arsenic accumulation in the heart,liver,spleen,lung and kidney of mice treated by three arsenolipidsNote：Group AsHC 332,Group AsHC 346,and Group AsHC 374 were compared with solvent control Group,where *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,and ****P<0.000 1.

2.3 3种砷脂对小鼠整体的砷蓄积情况

由图3可知,3种砷脂摄入后会对小鼠整体造成砷蓄积。以AsHC 332和AsHC 346为例,二者的摄入肾脏中的砷蓄积作用是最强的,其次是肝脏,这是因为肝脏和肾脏是砷化合物在体内代谢、蓄积和慢性毒作用的主要靶器官,因而其组织结构和功能极易受到损伤[17-18]。有趣的是,对AsHC 374来说,砷蓄积作用最强的脏器是心脏、其次是肝脏和肾脏,因为心脏也是脂质代谢的场所[39],这可能与AsHC 374在心脏发生的代谢相关。

图3 3种砷脂对小鼠整体的砷蓄积情况注：(a)为AsHC 332,(b)为AsHC 346,(c)为AsHC 374;心、肝、脾、肺与肾进行比较,其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。Fig.3 Overall arsenic accumulation in mice treated by three arseniolipidsNotes：(a) for AsHC 332,(b) for AsHC 346,and (c) for AsHC 374;heart,liver,spleen,and lungs were compared with kidneys,where *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 and ****P<0.000 1.

2.4 3种砷脂对小鼠肝脏中12种矿物元素水平的影响

由表3可知,3种砷脂的摄入导致小鼠肝脏中12种矿物元素水平发生变化。与溶剂对照组相比,AsHC 332使Na、Mg和Cr元素显著上升,K、Co、Ni和Se元素显著降低;AsHC 346使Na元素显著上升,K、Zn、Fe、Ni和Se元素显著降低;AsHC 374使Na和Ca元素显著上升,Cu、Zn、Fe、Co、Ni、Mn和Se元素显著降低。总之,砷脂摄入会引起肝脏内12种矿物元素水平发生显著变化,特别是Se、Co、Cu、Zn等与抗氧化酶相关元素的代谢紊乱[30],这可能与砷脂的肝脏毒性有关。

表3 3种砷脂对小鼠肝脏12种矿物元素含量的影响Tab.3 Effects of three arsenolipids on the content of 12 mineral elements in the liver of mice

2.5 3种砷脂对小鼠肾脏中12种矿物元素水平的影响

由表4可知,3种砷脂的摄入导致小鼠肾脏中12种矿物元素水平发生变化。与溶剂对照组相比,AsHC 332使Na、Fe、Mn、Se和Cr元素显著上升,Ni元素显著降低;AsHC 346使Na元素显著上升,Fe和Ni元素显著降低;AsHC 374使Na元素显著上升,Ca和Ni元素显著降低。总之,砷脂摄入会引起肾脏内7种矿物元素水平发生显著变化,包括Se、Fe、Mn等与抗氧化酶相关元素的代谢紊乱[30],这可能与砷脂的肾脏毒性有关。

表4 3种砷脂对小鼠肾脏12种矿物元素含量的影响Tab.4 Effects of three arsenolipids on the content of 12 mineral elements in the kidney of mice

3 结论

海产品中富含各种形态的砷,砷的毒性又与其形态息息相关。随着科技的发展,研究者们对有机砷的认识越来越深入,发现砷脂并非无毒,有些砷脂可以穿越血脑屏障在脑组织中蓄积,影响神经系统从而对人类健康造成潜在危害,甚至有些砷脂的毒性比无机砷更强,因而人们对砷脂可能具有的毒性感兴趣。本研究利用ICP-MS检测方法同步检测小鼠脏器中As、K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Co、Ni、Mn、Se和Cr元素含量,初步判断砷脂摄入对小鼠肝肾组织的可能影响。研究结果表明,短期砷脂暴露不会影响小鼠的正常生长发育,但会在小鼠内脏中引起砷蓄积,不同砷脂的砷蓄积作用不同,但总的来说,肾脏的砷蓄积作用最强,肝脏次之。此外,砷脂的摄入会引起肝脏内K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Co、Ni、Mn、Se和Cr这12种矿物元素水平和肾脏内Na、Ca、Fe、Ni、Mn、Se和Cr这7种矿物元素水平发生显著变化,尤其是造成Cu、Zn、Se、Fe、Mn等与抗氧化酶合成相关的元素代谢紊乱,说明其具有一定的肝脏毒性和肾脏毒性,但具体毒性大小和毒作用机制有待深入研究。总之,本研究可为后续深入研究砷脂的肝脏和肾脏毒作用机制提供实验基础,为海产品中砷的风险评估提供数据支撑。