低共熔溶剂快速萃取-液质联用法定量测定养殖水体中孔雀石绿残留

李凯华,张杨,肖曼,徐媛原,林敏霞,林英扬,吴丹,魏芝芝,钟仕花

(深圳市质量安全检验检测研究院,深圳 518055)

低共熔溶剂(Deep eutectic solvents,DESs),是指由一定摩尔质量比的氢键受体和氢键供体组合熔溶形成的不同组分混合物,由Abbott等[1-2]于2003年首次报道。DESs的物理、化学性质与离子液体非常相似,因此也有人把其归为一类新型离子液体或离子液体类似物,可广泛应用于各个领域[3-5]。DESs正在成为一类新的可持续溶剂,通常被认为是可再生的、廉价的和绿色的“设计”溶剂,具有低挥发性、可生物降解、成本低、环境友好等优势[6],减少了有机溶剂提取剂对实验人员的健康影响,符合当前环保理念[7]。常见的可组成DESs氢键受体有季铵盐(如氯化胆碱)、两性离子(如甜菜碱)等,以氯化胆碱最常用;氢键供体有胺类、多元醇类等[8-10]。DESs的研究多集中在食品添加色素萃取检测领域,刘慧强等[11]利用低共熔溶剂萃取液相色谱法检测调味油中的酸性橙和碱性橙等食品中禁用的工业染料,考察了几种不同DESs的提取效率,为食品中非法添加剂残留检测提供了新方法。周佳等[12]利用低共熔溶剂萃取高效液相色谱-串联质谱法测定了肉制品和水产品中的3种非法添加剂,拓展了DESs的应用领域。蔡娜娜等[13]对低共熔溶剂的形成机理和应用进行了进一步研究,为开发利用低共熔溶剂提供新思路。

孔雀石绿(Malachite green,MG)是一种有毒的三苯甲烷类人工合成有机化合物,既是染料,也是杀菌剂,因其廉价及杀菌作用好,曾被广泛用于水产养殖治疗水霉病等。在生物体内,孔雀石绿被还原为稳定的隐色孔雀石绿(Leucomalachite green,LMG),其在生物体内蓄积、残留时间长。经研究,孔雀石绿及代谢物隐色孔雀石绿具有致癌、致畸和致突变作用,已被中国在内的多个国家列入食品生产中禁用药物[14-15]。

中国渔业养殖规模大,水产贸易值及人均消费量占食品消费比重持续增高[16],水产品质量安全显得尤为重要。同时,种植、养殖等农业活动中大量使用的农药、兽药会通过陆源输入进入水环境中,成为影响水产品质量安全的风险因子。目前,国内水产品中孔雀石绿检测的标准方法有GB/T 19857—2005[17]、GB/T 20361—2006[18]、SC/T 3021—2004[19]、SC/T 9435—2019[20]等液相及液质检测方法。养殖水体中的孔雀石绿检测方法多为乙腈等有机溶剂提取,固相萃取柱富集净化等前处理方式,SC/T 9435—2019《水产养殖环境(水体、底泥)中孔雀石绿的高效液相色谱法测定》利用乙腈和二氯甲烷混合提取、固相萃取柱富集净化,液相色谱分离测定。赵东豪等[21]建立了水产养殖水体中49种兽药的残留量检测方法,利用固相萃取法和冷冻干燥法测定,效果显著,但耗时较长。张秀妍等[22]建立液相色谱串联质谱法测定养殖水体中的孔雀石绿,水样经二氯甲烷萃取浓缩,以1 mL浓度为50%的乙腈-乙酸铵溶液定容,内标法定量检测,方法定量限为0.010 ng/mL,经验证适用于养殖水体中孔雀石绿的测定。

本方法参考DESs萃取色素等非法添加剂的研究成果,研究了几种不同低共熔溶剂的萃取效果,建立了养殖水体中孔雀石绿的快速高效萃取富集、液质联用定量检测方法,并为水产品、水产养殖环境(水质、底泥)中农兽药残留检测方法研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用养殖用水来源于水产暂养池养殖用水。

四丁基溴化铵(色谱级,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);正辛醇(分析纯,天津大茂化学试剂厂);二乙二醇(色谱纯,MACKUN麦克林公司);三乙醇胺(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);正丁醇(分析纯,天津大茂化学试剂厂);乙腈(色谱纯,德国默克股份两合公司);乙酸铵(色谱级,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲酸(色谱纯97%,阿法埃莎(中国)化学有限公司);超纯水。

孔雀石绿(纯度91%)、隐色孔雀石绿(纯度99.99%)、D5孔雀石绿(纯度97.6%)、D6隐色孔雀石绿(纯度96.5%),均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

1290 InfinityⅡ、TripleQuad5500液相色谱-串联四级杆质谱仪(配ESI离子源,安捷伦、爱博才思公司);电导率仪(梅特勒托利多科技(中国)有限公司);Milli-Q Reference纯水处理仪(法国Millipore公司);BSA2202S-CW型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);AS 30600BDT超声波清洗仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);旋涡振荡器(美国Scientific Industries公司);0.22 μm有机滤膜(津腾,紫色膜)。

1.3 试剂制备

1.3.1 DESs制备

DESs的制备参考丁勇等[21]研究,选取四丁基溴化铵作为DESs氢键受体,二乙二醇、正辛醇、三乙醇胺和正丁醇4种多元醇或胺作为氢键供体进行对比实验。按照一定摩尔比,分别称取一定量的氢键供体和氢键受体于平底烧瓶,在60 ℃水浴锅中加热溶解,直到混合物完全变成澄清、透明液体,室温冷却备用。

1.3.2 乙酸铵溶液配制

准确称取乙酸铵38.50 g,超纯水溶解并定容至1 000 mL,配制成浓度为0.50 mol/L的乙酸铵溶液,4 ℃冷藏保存。流动相乙酸铵溶液配制,准确称取乙酸铵0.385 g,超纯水溶解并定容至999.50 mL,配制成浓度为5 mmol/L的乙酸铵溶液,加0.50 mL甲酸混匀。

1.3.3 标准溶液配制

准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、D5孔雀石绿和D6隐色孔雀石绿,分别用乙腈溶解配制成浓度为1 000 μg/mL的母液。逐级稀释,乙腈定容,配制成孔雀石绿和隐色孔雀石绿混合外标标准工作溶液100 μg/L和10 μg/L;D5孔雀石绿和D6隐色孔雀石绿混合内标标准工作溶液1 000 μg/L和100 μg/L,-18 ℃条件下保存。

1.4 仪器条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：BEH C18(3.0 mm×50 mm,1.7 μm);柱温：40 ℃;进样量：2 μL;流速：0.50 mL/min;流动相A：乙腈;流动相B：盐溶液(5 mmol/L乙酸铵+0.05%甲酸溶液)。

1.4.2 质谱条件

离子化模式：大气压电喷雾离子源(ESI),正离子模式;扫描方式：多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM);离子化电压：5 500 V(正离子模式),离子源温度：550 ℃,喷雾气(GS1)、辅助气(GS2)、气帘气(CUR)、碰撞气(CAD)均为高纯氮气,使用前调节气体流量使质谱灵敏度达到检测要求。待测物母离子、定量定性离子、去簇电压和碰撞电压见表1。

表1 MRM扫描模式的参数Tab.1 Parameters of MRM

1.5 样品处理

养殖水经0.45 μm滤膜过滤备用。取10 mL过滤后的养殖水,加入适量混合内标标准溶液和乙酸铵溶液,旋涡混匀。准确移取1 mL水样至离心管内,加入低共熔溶剂,加盖旋涡混匀1～2 min,静置萃取5 min,待分层后,取全部上层萃取液至进样瓶中,乙腈定容至1 mL,过0.22 μm有机滤膜,上机待测。

1.6 标准工作曲线绘制

准确移取100 μg/L的孔雀石绿和隐色孔雀石绿混合外标工作溶液,用乙腈乙酸铵溶液(1.3.2流动相乙酸铵溶液,v/v=7∶3)稀释成浓度为5、10、20、50和100 μg/L的孔雀石绿和隐色孔雀石绿混合标准工作溶液;同样准确移取100 μg/L的D5孔雀石绿和D6隐色孔雀石绿混合内标工作溶液20 μL,配制成内标浓度均为2.00 μg/L的标准工作曲线。

1.7 添加实验

向已知10 mL空白养殖水中分别添加5、20和50 μL浓度为1 000 μg/L的孔雀石绿外标混合工作液,得到含量为0.5、2.0、5.0 μg/L的孔雀石绿和隐色孔雀石绿加标样品,按2.5实验方法进行处理测定,并计算方法线性范围、检出限、精密度和回收率。

1.8 数据处理

采用ESI电喷雾离子源,正离子扫描模式,分别对孔雀石绿和隐色孔雀石绿监测其母离子和2个子离子,母离子和子离子组成监测离子对,以MRM多反应监测对待测物进行定性,内标法进行定量分析。建立数据处理方法时,先检测一个中浓度目标物,待所有离子出峰完成后,在爱博才思(AB)工作站中,按照相应离子出峰时间、半峰宽等参数,选择使用曲线(不过零点)、对应的内标物来进行定量数据分析。

2 结果与分析

2.1 低共熔溶剂种类选择

参照DESs组分及配比研究,本次试验选择四丁基溴化铵作为DESs氢键受体,二乙二醇、正辛醇、三乙醇胺和正丁醇4种多元醇作为氢键供体,按照摩尔比1∶2进行熔溶对比试验。发现四丁基溴化铵和二乙二醇、三乙醇胺和正丁醇混合加热溶解后液体均澄清,但在试验中,分别加入上述DESs 400 μL于1 mL养殖水样品中,混匀静置,未分层。四丁基溴化铵和正辛醇进行混合加热溶解,液体澄清。在试验中,加入该DESs 400 μL于1 mL养殖水样品,混匀静置,呈油状液滴浮于水面,分层明显。

2.2 低共熔溶剂配比考察

以四丁基溴化铵作为DESs氢键受体,正辛醇作为氢键供体,按照摩尔比1∶2、1∶3、1∶4和1∶5,进行熔溶考察试验,发现不同配比混合加热后,均能形成澄清透明均一溶液,但溶液随着氢键供体正辛醇增加,黏度变小。试验统一在3组平行样品中添加400 μL DESs的情况下,考察不同摩尔比对萃取效果的影响,发现按照摩尔比1∶4混合配制的DESs孔雀石绿和隐色孔雀石绿实验离子强度最高,摩尔比1∶3混合配制的DESs回收率稳定(图1),最终选取摩尔比为1∶3的DESs作为试验萃取溶剂。

图1 不同摩尔比DESs对离子强度和样品回收率的影响(样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿添加浓度2.00 μg/L,n=3)Fig.1 Effects of DESs on ion strength and sample recovery with different molar ratios(Malachite green and Leucomalachite green were added at concentrations of 2.00 μg/L,n=3)

2.3 低共熔溶剂用量考察

添加摩尔比1∶3的DESs 100、200、300、400、500和 600 μL,发现添加100 μL DESs,未能形成明显上层清液,添加200 μL DESs,萃取分层后,得到上清液约100 μL;当添加400 μL DESs,萃取分层后,得到上清液约200 μL,质谱离子强度最高,孔雀石绿和隐色孔雀石绿实验回收率均稳定。随着添加量增加,萃取分层越明显,但离子响应强度有减弱现象(图2),最终选择添加400 μL DESs作为本试验的最佳用量。

图2 DESs添加量对离子响应和样品回收率的影响(样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿添加浓度2.00 μg/L,n=3)Fig.2 Effect of DESs additive level on ion response and sample recovery rate (malachite green and leucomalachite green were added at concentrations of 2.00 μg/L,n=3)

2.4 低共熔溶剂电导率测定

室温25 ℃条件下,分别对摩尔比1∶2、1∶3、1∶4和1∶5的DESs溶液进行电导率测定,分别测得DESs溶液电导率为244.7、209.5、140.3和90.6 μS/cm。

2.5 乙酸铵溶液添加实验

乙酸铵是农兽药残留常用辅助离子化试剂。利用乙酸铵溶液离子化特性进行对照试验,一组试验在6个平行养殖水样品中添加乙酸铵和不添加乙酸铵溶液进行对照,另一组分别向3个平行养殖水样品中添加50、100、150、200和250 μL的乙酸铵溶液,在统一添加摩尔比1∶3的DESs萃取剂400 μL条件下,考察添加适当浓度乙酸铵溶液对孔雀石绿和隐色孔雀石绿离子强度和添加回收率的影响。在进行6个平行养殖水样品中添加乙酸铵和不添加乙酸铵溶液进行对照试验中,发现添加乙酸铵样品溶液中检测孔雀石绿平均离子强度高于未添加乙酸铵溶液,而隐色孔雀石绿离子强度相当。未添加乙酸铵样品溶液中检测孔雀石绿平均回收率<60%,而隐色孔雀石绿回收率>120%,而添加乙酸铵样品溶液中孔雀石绿和隐色孔雀石绿回收率均在正常范围(表2);在3个平行养殖水样品中添加50、100、150、200和250 μL的乙酸铵溶液实验中,发现添加浓度为0.5 mol/L的乙酸铵溶液200 μL条件下孔雀石绿和隐色孔雀石绿离子强度处于中等水平,但回收率最稳定(图3)。综上,选择添加0.5 mol/L的乙酸铵溶液200 μL作为本试验的最优添加量。

图3 乙酸铵溶液添加量对离子强度和回收率的影响(样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿添加浓度2.00 μg/L,n=3)Fig.3 Effect of ammonium acetate additive level on ion response strength and recovery rate(Malachite green and Leucomalachite green were added at concentrations of 2.00 μg/L,n=3)

表2 乙酸铵对回收率和离子强度影响Tab.2 Effect of ammonium acetate on recovery rate and ion response strength n=6

2.6 甲酸添加试验

在养殖水体样品中添加一定剂量的甲酸,对水体进行酸化处理。经检测,与未添加甲酸养殖水样品检测孔雀石绿和隐色孔雀石绿对比,对目标物提取及离子峰形等未产生明显作用,因此该养殖水体前处理方法无需添加甲酸。

2.7 标准曲线和离子图谱

用流动相作为标准曲线定容液。标准曲线回归方程和相关系数见表3;加标浓度2.00 μg/L样品的孔雀石绿离子流色谱图见图4;加标浓度2.00 μg/L样品的隐色孔雀石绿离子流色谱图见图5。

图4 孔雀石绿2.00 μg/L色谱基线及离子出峰时间Fig.4 Chromatographic baseline and ion peak exit time of malachite green 2.00 μg/L

图5 隐色孔雀石绿2.00 μg/L色谱基线及离子出峰时间Fig.5 Chromatographic baseline and ion peak exit time of leucomalachite green 2.00 μg/L

表3 标准曲线回归方程、相关系数表和检出限Tab.3 Standard curve regression equation,correlation coefficient table and detection limit

2.8 方法检出限、回收率和精密度实验

2.8.1 方法检出限

以空白养殖水为基质,最低添加浓度进行实验,依据GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[23]确定检出限的方法,采用信噪比法计算检出限,根据3倍信噪比确定该方法的检出限见表3,孔雀石绿和隐色孔雀石绿的方法检出限分别为0.006 3和0.003 0 μg/L,说明该方法灵敏度较高。

2.8.2 回收率和精密度

向已知未检出养殖水中分别添加5、20和50 μL浓度为1 000 μg/L的孔雀石绿混合外标工作液,得到含量为0.5、2.0、5.0 μg/L的孔雀石绿和隐色孔雀石绿加标样品,按1.5实验方法进行处理测定,平行测定6次,实验结果测得孔雀石绿的回收率分别为91.9%、110.4%和109.7%,相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)分别为8.3%、5.4%和3.6%。隐色孔雀石绿的回收率分别为76.4%、110.8%和115.8%,RSD分别为7.0%、4.4%和3.0%(表4)。

表4 回收率和相对标准偏差Tab.4 Recovery rate and relative standard deviation n=6

3 讨论

对于DESs的形成机理,普遍认为是氢键的作用,也有认为是离子键、范德华力[24]共同作用形成。四丁基溴化铵是一种有机盐,分子式为C16H36BrN,纯品为白色晶体或粉末,其熔点为117 ℃,氢键受体数量为1。正辛醇是一种有机化合物和饱和脂肪醇,分子式为C8H18O,常温下是无色透明状液体,其熔点为-16.7 ℃,氢键供体数量为1,氢键受体数量为1。DESs的电导率随着氢键供体正辛醇含量的增加而减小,随着四丁基溴化铵含量的增加而增加。

利用四丁基溴化铵作为DESs氢键受体,正辛醇作为氢键供体制备的DESs,对富集萃取孔雀石绿、隐色孔雀石绿具有较好的选择性,孔雀石绿作为三苯甲烷类工业色素染料,研究表明DESs对色素染料具有较好的富集萃取作用[25]。DESs的熔点、黏度、电导性和溶解性随氢键供体和受体选择及摩尔比率变化而变化,并对萃取产生影响。因此,需要选择适当的DESs对目标物进行富集萃取。

本次利用DESs萃取富集养殖水体中孔雀石绿和隐色孔雀石绿试验,样本量为10 mL,取1 mL样本进行快速萃取富集,乙腈定容混匀溶解。为防止养殖水体中藻类等杂质影响色谱柱和质谱系统,导致系统污染、基质效应,最后定容液须经过0.22 μm有机滤膜过滤,进行有效除杂,保护色谱柱和质谱系统。

乙酸铵溶液常被用于液相质谱流动相中,与甲酸、乙酸等配制形成低离子强度的缓冲溶液,有利于分析不同pH值的化合物,有改善峰形、提高柱效和保护色谱柱等作用[26]。本次养殖水体中直接加入一定摩尔浓度的乙酸铵溶液,经实验比对,对改善目标物离子峰形及稳定回收率发挥重要作用。

定量限、检测限比较,以信噪比S/N≥3确定检出限,S/N≥10确定定量限。本试验测得孔雀石绿和隐色孔雀石绿的方法检出限分别为0.006 3和0.003 0 μg/L。综合对比张秀妍等[22]建立液相色谱串联质谱法测定养殖水体中的孔雀石绿,定量限0.010 ng/mL(检出限0.005 ng/mL)。丁勇等[27]液相色谱-串联质谱法同时测定养殖水体中孔雀石绿和结晶紫含量,定量限2.0 ng/L。本试验测得孔雀石绿检出限与其他QuEChERS、固相萃取等方法检出限相当。

目前关于养殖水中的孔雀石绿检测方法研究较多,相关研究及标准[17-22]采用乙腈、二氯甲烷等有机溶剂提取、固相萃取柱富集、氮吹浓缩、定容,滤膜过滤等净化方式测定养殖水中孔雀石绿等方法,效果显著,缺点是试剂耗量大,耗时较长。DESs在农兽药领域应用研究尚不多见,利用DESs快速萃取富集目标物,建立养殖水中孔雀石绿兽药残留的检测方法,无需过柱、氮吹浓缩,不仅环保,而且节约时间、试剂和耗材,节省了实验室资源,并为利用低共熔溶剂快速高效萃取养殖环境及水产品中多种农兽药残留、液质定量测定提供更广阔的研究思路。

4 结论

水产品兽药残留检测中,禁用兽药孔雀石绿常有检出,说明在养殖或运输环节中,依然存在违规添加孔雀石绿的风险。本试验方法在10 mL过滤水样中,加入适量内标物质和0.5 mol/L的乙酸铵溶液200 μL,混匀取1 mL水样于微量离心管中,加入400 μL以四丁基溴化铵作为氢键受体,正辛醇作为氢键供体,按照摩尔比1∶3混合制备的 DESs,涡旋混匀静置提取上层萃取液,乙腈定容至1 mL,过0.22 μm有机滤膜,使用液质联用仪进行定量测定,其优点是萃取及检测试剂消耗少、耗时短、灵敏度高、准确性好。通过验证,该方法适用于开展养殖水体中孔雀石绿的快速定量检测,并为下一步探索利用低共熔溶剂萃取养殖环境及水产品中多种农兽药残留检测方法研究提供参考方向。