鲢嗜麦芽窄食单胞菌分离及药敏试验

林松泉

（厦门惠盈动物科技有限公司，福建 厦门 361023）

鲢（Hypophthalmichthys molitrix），属鲤形目，鲤科，鲢亚科，鲢属，俗称鲢子、白鲢、边鱼。鲢广泛分布于亚洲东部，在我国各大水系，随处可见，是著名的四大家鱼之一。鲢是典型的滤食性鱼类，在鱼苗阶段，主要摄食浮游动物，体长＞1.5 cm 时，逐渐转为吃浮游植物，亦吃豆浆、豆渣粉、麸皮和米糠等，更喜吃人工微颗粒配合饲料，为我国主要的淡水养殖鱼类之一。

2021 年6 月，福建佛昙某淡水鱼类养殖场中，突发鲢大面积死亡，多次用药，但效果不佳。死亡鲢体表出血，尤其在体表两侧、头部、鳃盖、鳍基等部位较为明显。解剖发现，其内脏也有不同程度充血，部分肠道出现肿胀，腹腔积有血水，肛门红肿。为查明鲢大面积死亡原因，对发病鲢肠道内容物、肛门出血分泌物及养殖塘池水中病原菌进行分离、鉴定，对分离菌进行致病性和药敏试验。

1 材料与方法

1.1 材料

营养琼脂（生产批号：1101791），来自广东环凯微生物科技有限公司；营养肉汤（生产批号：1094671），来自广东环凯微生物科技有限公司；无菌脱纤维兔血（生产批号：20230118001），来自南京全隆生物技术有限公司产品；15 种药敏纸片（生产批号：220512），来自杭州滨和微生物试剂有限公司。试验鱼缸（2 m×0.55 m×0.5 m）7 个。

1.2 方法

1.2.1 病菌分离、鉴定

取发病死亡的鲢肠道内容物、肛门出血分泌物及养殖塘池水样品各10 g，采用无菌生理盐水90 mL，分别对样品稀释10 倍，各取0.1 mL 涂布营养琼脂平板，28 ℃好氧培养48 h。对分离得到的菌株，选取活菌数较高的进行分离纯化，待纯化后染色、镜检，初步判断菌株类别后，进行16S rDNA 测序，其中正向引物为27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物为1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'[1]。经NCBI 数据库blast 同源性比对，从而确定菌株名称。

1.2.2 溶血性及致病性试验

将纯化后的菌株，挑取一环菌泥，稀释于无菌生理盐水中备用。将无菌圆形滤纸片贴于含5%的兔血琼脂平板上，吸取50 μL 菌液，接种于无菌圆形滤纸片上，28 ℃好氧培养48 h，观察有无溶血圈形成。

选取暂养1 周的健康鲢140 条，规格基本一致。设置7 组，1#—6#为试验组，7#为对照组，每组20 条鲢。配置病原菌浓度分别为4.0×103，4.0×104和4.0×105cfu/mL，每2 个缸加入1 种浓度病原菌，对照组不做任何处理。观察记录鱼患病症状及死亡时间，为期5 d，对死亡鲢解剖，分离病菌并鉴定。

1.2.3 药敏试验

将纯化后的菌株活化后，挑取一环菌泥采用无菌生理盐水稀释，使菌液浓度为1.0×108cfu/mL，备用。吸取1 mL 菌悬液，加入50 ℃100 mL 营养琼脂培养基中摇匀，倾倒平板，冷却凝固后贴上药敏纸片，静置15 min 后，将平皿置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察并测量抑菌圈直径大小。

2 结果与分析

2.1 病菌分离、鉴定

从发病死亡的鲢肠道内容物、肛门出血分泌物及养殖池塘水中，皆分离出2 株具较多活菌数的菌株，分别为X1，X2。这2 株菌在鲢肠道内容物、肛门出血分泌物中活菌数均约8.0×105cfu/mL，在养殖塘池水中活菌数约4.0×104cfu/mL。通过16S rDNA 测序，经NCBI 数据库blast 同源性比对，X1 菌株与嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophom-onas maltophilia）SD28L的核苷酸系列同源性为99.93%；X2 菌株与嗜水气单胞菌（Aero-monas hydrophila）CH-GX-YL-BL-1-2021 的核苷酸系列同源性为100%。

嗜麦芽窄食单胞菌，广泛存在于水、土壤、下水道污水中，为条件致病菌。国内对该菌株的研究报道多数在耐药机制及人类感染防治方面[2-5]，而在水产动物方面鲜有报道[6]。嗜水气单胞菌为人畜及淡水水产动物共患的条件致病菌，可感染多种水产动物，多数表现为出血性败血症[7-11]。

2.2 溶血性及致病性

溶血性试验结果表明，X1、X2 菌株皆具有溶血性，其中X1 溶血圈（23.23±0.22）mm，X2 溶血圈（20.42±0.35）mm。

在X1、X2 菌株的致病性试验中发现，2 株菌株均可导致鲢死亡。养殖水环境中，不同菌浓度导致鲢死亡情况不同。对照组在试验观察期内，未出现死亡。随着水体中菌浓度增加，鲢的死亡率升高，且死亡时间较提前，呈正相关。取死亡的鲢解剖，从内脏组织、血液中均分离出原感染菌，经鉴定与原菌株一致。

X1、X2 菌株对健康鲢致病试验结果见表1。由表1 可见，当X1、X2 菌株水体活菌数在4.0×103cfu/mL 时，其死亡率较低，致病性不强；在4.0×104cfu/mL 时，致病性大幅度提高，且X1 菌株的致病性比X2 菌株强。

表1 X1、X2 菌株对健康鲢致病试验结果

2.3 药物敏感性

采用15 种抗生素，对X1 菌株进行药敏试验。结果显示，X1 菌株对试验15 种抗生素均表现出耐药性，说明X1 菌株具有较强的耐药能力，见表2。有研究表明[12-13]，嗜麦芽窄食单胞菌对头孢类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类与碳青酶烯类等大多数常用抗菌药物具有不同的耐药性。其耐药机制：一是产生各种灭活酶，降低抗生素对自身的危害，如β-内酰胺酶[14]、氨基糖苷类钝化酶[15-17]；二是通过改变自身细胞膜通透性[18-19]，阻碍一些抗菌药物进入，从而对许多抗菌药物产生耐药。

表2 X1 菌株对15 种药敏纸片的敏感性

X2 菌株对阿莫西林、复方新诺明耐药，对卡那霉素、利福平敏感中介，而对新霉素、氯霉素、青霉素G 等11 种抗生素敏感，见表3。由表3 可见，本试验结果与文献[20-22]研究结果，存在不同程度的差异，说明来自不同区域或养殖品种的差异，导致病原菌具有不同的耐药性。

表3 X2 菌株对15 种药敏纸片的敏感性

3 结论

从发病死亡的鲢肠道内容物、肛门出血分泌物及养殖塘池水中，分离得到2 株病原菌，X1 为嗜麦芽窄食单胞菌，X2 为嗜水气单胞菌。对这2 菌株的致病性及药物敏感性进行试验，发现该2 株菌株对兔血具有溶血性，当水体病菌浓度高于4.0×104cfu/mL时，对鲢的致死率大幅度上升，且嗜麦芽窄食单胞菌的致病性高于嗜水气单胞菌。嗜麦芽窄食单胞菌对15 种抗生素表现出耐药性，嗜水气单胞菌对新霉素、氯霉素、青霉素G 等11 种抗生素敏感，对阿莫西林、复方新诺明表现出耐药性。