北京动物园圈养野生动物病原菌分布及耐药性分析

刘燕，詹同彤，胡昕，卢岩，郝菲儿，由玉岩，崔多英，刘赫，滑荣，张成林

（北京动物园管理处，圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京 100044）

病原菌一直是威胁圈养条件下野生动物健康的重要因素之一（张成林等，2013；侯超鹏，2019）。抗生素对圈养动物病原细菌感染治疗可以起到良好的效果，但是条件性致病细菌的感染仍时有发生。在圈养条件下，不同种类野生动物间以及野生动物与人类包括游人和饲养员等近距离接触机会大幅增加，人畜共患病原菌和耐药菌在动物间以及人与动物间传播的风险也随之增加（秦春娥等，2007），对动物和人类健康都会造成一定威胁，增加公共卫生风险（张劲硕等，2003）。因此，对圈养条件下动物感染的病原菌分离、监测非常重要。

北京动物园饲养展示珍稀野生动物约400 种5 000余只，发挥着国家动物园功能，平均每年接待游客量近千万，在圈养野生动物疾病治疗方面，多年来一直开展病死动物的病原菌分离鉴定和药敏试验，本文统计了2005—2016 年12 年北京动物园圈养的死亡和患病的537 只野生动物的细菌感染情况，并分析了病原菌的分布特点和抗药性，以期为临床细菌性疾病治疗中的药物选择提供参考，避免抗生素滥用和耐药菌株产生、传播、流行，并为制定野生动物抗菌药物应用策略、管理措施及评价干预手段等提供数据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

采集2005—2016 年北京动物园死亡和患病的168 种537 只圈养野生动物的935 份样本，包括哺乳动物99 种365 只、鸟类54 种143 只和两栖爬行类15 种29 只，其中，死亡动物424 只803 份样本，患病动物113 只132 份样本。死亡动物根据呼吸系统、消化系统等死亡原因取肝脏、肺脏、脾脏、心脏、肾脏、肠道内容物等病变脏器组织；患病动物根据具体病情采集包括脓液、鼻腔分泌物、咽拭子等样本。所有死亡动物均在死亡5 h 内进行剖检采样，尽量减少杂菌污染。病变脏器采集采用75%乙醇溶液擦拭脏器表面后用无菌剪刀剪取3 cm×3 cm 组织，脓液采集使用无菌注射器抽取液体，鼻腔分泌物和咽喉、扁桃体采用无菌棉签蘸取分泌物，放入无菌袋，立即4 ℃送检。

1.2 试剂与培养基

MH 培养琼脂、麦康凯培养琼脂和普通营养培养琼脂（青岛海博生物技术有限公司）、10%脱纤维羊血营养琼脂（自制）、API 鉴定试剂条（法国生物梅里埃股份有限公司）、药敏片（北京天坛药物生物技术开发公司）等。

1.3 病原菌分离鉴定方法

将脏器样本置于超净工作台，75%乙醇溶液擦拭消毒表面，用无菌剪刀剪去样本表面组织后，用无菌接种针蘸取组织涂抹接种于10%脱纤维羊血营养琼脂、MH 等培养基中，37 ℃培养。玻片革兰氏染色后镜检。将镜检疑似为链球菌属Streptococcus感染样本置于CO2培养箱中培养，疑似魏氏梭菌Clostridium welchii感染样本置于厌氧环境培养。培养24～48 h。分离菌株接种于血液琼脂上培养，直至纯化。将纯化好的菌株接种于相关生化反应管或API鉴定试剂条，进行菌株鉴定。综合镜检和培养结果综合判定样本中是否存在病原菌。

1.4 药物敏感试验

将获得的大肠杆菌Escherichia coli、葡萄球菌属Staphylococcus、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae和奇异变形杆菌Proteus mirabilis按北京动物园临床治疗常用的部分抗生素（头孢克肟、头孢曲松、庆大霉素、阿奇霉素、诺氟沙星、阿莫西林/克拉维酸、青霉素、磺胺）进行药敏试验。采用K-B纸片琼脂扩散法进行药敏试验：用无菌棉签蘸取待测菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于10 cm 鲜血平板，待稍干后，用无菌镊子将药敏纸片分别平贴在培养基表面，4 ℃ 2 h 使药物扩散，然后37 ℃培养24 h，按照NCCLS（1999）标准判断药物敏感结果。使用大肠杆菌ATCC 25922菌株进行质控。

2 结果与分析

2.1 不同种类动物病原菌分离情况

307 只动物样本检出病原菌，检出率57.17%，其中，哺乳动物56.16%，鸟类61.52%，两栖爬行动物48.27%。

2.2 不同病变脏器病原菌分离情况

病原菌检出样本共515份，占55.08%，其中，肝脏、肺脏的样本比例较高，分别为31.33% 和22.46%；从标本病原菌检出率来看，肺脏（62.38%）最高，并高于肝脏（43.69%）（表1）。

表1 2005—2016年北京动物园圈养野生动物病/死动物的样本种类、数量和病原菌检出率Table 1 Sample type，number and detection rate of bacterial pathogens from captive sick/dead animalsin Beijing Zoo from 2005 to 2016

2.3 病原菌分布

935份样本共分离到580株细菌，其中，革兰氏阴性菌372 株，占64.14%，主要是肠杆菌科Enterobacteriaceae；革兰氏阳性菌208 株，占35.86%（表2），主要是链球菌属、梭状芽孢杆菌属Clostridium和葡萄球菌属。条件性致病菌占绝大多数，包括大肠杆菌、链球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和魏氏梭菌等。

表2 2005—2016年北京动物园圈养野生动物病/死动物病原菌信息Table 2 Pathogenic bacteria of captive sick/dead animals in Beijing Zoo from 2005 to 2016

2.4 耐药性分析

药敏试验结果显示（表3），4 种菌株对磺胺耐药性最高（44.44%～78.57%），其次是对青霉素的耐药性（25.00%～50.00%）。其他耐药性较高的还有：葡萄球菌属对头孢克肟的耐药性达到44.44%，大肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸的耐药性达到36.36%。

表3 4种主要病原菌对抗生素的耐药结果Table 3 Drug resistance result of four kinds of pathogenic bacteria

3 讨论

本文总结了2005—2016 年北京动物园患病和死亡动物的病原菌检出率和耐药情况，在待检样本数量上，哺乳动物数量较多，鸟类较少，两栖爬行类最少。总病原菌检出率为57.17%，略低于杭州动物园的65.19%（黄淑芳等，2017）。总体反映出细菌性感染疾病是北京动物园圈养野生动物发病和死亡的重要原因。

从病原菌分离的脏器类型来看，肺脏最高，说明呼吸道发生细菌性感染疾病几率较高，这与尹秀云等（2014）的研究结果一致。从致病细菌类型来看，条件性致病菌占多数，如大肠杆菌、链球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和魏氏梭菌等。其中，61.52%鸟类样本检出的致病菌80%以上是大肠杆菌，说明圈养条件下，鸟类应重点预防大肠杆菌的感染。可以通过提供最适营养配比的饲料、提高圈养环境条件、减少应激反应等提升动物福利，最大限度减少致病菌大肠杆菌感染的几率，保障圈养鸟类健康。

580 株菌株中，最多的革兰氏阴性菌是肠杆菌科，而占比较高的是链球菌属、梭状芽孢杆菌属和葡萄球菌属，其中，魏氏梭菌的分离率达到9.14%。从药敏试验结果看，大肠杆菌对磺胺、青霉素的耐药性高达44.44%～78.57%，与已有报道（周万蓉，2007；黄淑芳等，2011；刘青等，2020）相比，低于家畜源，而高于野生动物源（梁冰等，2020；李运莉等，2022；王东阳等，2022）。葡萄球菌对8 种抗生素普遍具有一定的耐药性，但对诺氟沙星、庆大霉素较敏感，与已有研究结果（马小萍等，2016；张志忠等，2017；王光锋，李航，2020；吴胜等，2020）基本相同。肺炎克雷伯氏菌菌株对磺胺、青霉素等耐药率非常高，对头孢曲松、阿莫西林等较敏感，与此前报道的梅花鹿Cervus nippon源和东非黑白疣猴Colobus guereza源肺炎克雷伯氏菌对阿莫西林普遍耐药（王艳君等，2018a；张召兴等，2019；郭蕊等，2021；王炜强等，2022；燕霞等，2022）有一定差异。奇异变形杆菌菌株对8 种抗生素普遍较敏感，但对磺胺耐药，与已有研究结果（庞卓等，2010；王丽萍等，2016；王艳君等，2018b；朱洪军等，2019）较为一致。

综上所述，圈养条件下细菌性疾病治疗应根据药敏结果选用窄谱抗生素，避免耐药菌株的出现。针对病原菌株进行药敏试验非常必要，能反映圈养野生动物源致病菌的抗生素耐药情况，指导临床用药，可以避免耐药菌株甚至超级菌的出现，减少人畜共患病发生的几率。