HDAC6调控在脓毒症致急性呼吸窘迫综合征中的研究进展

王萌 陈乾 李华

脓毒症是感染引起的宿主反应失调,进而导致危及生命的器官功能障碍的临床综合征,肺脏是最易受损的靶器官之一[1]。脓毒症发生时,肺泡毛细血管膜通透性增加,炎症细胞浸润,形成严重肺水肿,最终导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[2],而肺血管内皮细胞(pulmonary vascular endothelial cell,PVEC)是最早受损且损伤最严重的靶细胞[3]。ARDS全球发病率高,每年超过三百万,且死亡率居高不下(34.9%～46.1%)[4-5]。近年来,越来越多的研究表明组蛋白乙酰化可通过炎症抑制、细胞调控在ARDS中发挥保护性作用[6]。组蛋白乙酰化的状态受组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的共同调节[7]。其中,HDAC6是HDAC家族中最大的蛋白质,且可通过调控非组蛋白底物及信号通路在细胞中发挥作用。本文就HDAC6在ARDS中的研究进展简述如下。

一、脓毒症致ARDS的病理机制

首先,许多研究表明脓毒症中的早期氧化应激和过度的炎症反应是ARDS的关键。脓毒症期间刺激原激活P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases,P38 MAPK)、细胞内核转录因子 κB(NF-κB)等炎症通路,大量炎性细胞和细胞因子聚集,从而导致肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞受损,肺泡毛细血管膜通透性增加,形成肺水肿[7-8]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是细胞有氧呼吸的代谢产物,当体内活性氧生成过度,氧化应激增强,ROS可以与多种细胞因子相互作用,促进促炎细胞因子和粘附分子如ICAM-1/VCAM-1的表达,从而促进炎症级联反应的形成。同时,在内毒素诱导的ARDS动物模型中伴有NO、iNOS、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白细胞介素-1β (IL-1β)等主要炎症介质的增加[9-10],也同样证明全身炎症反应失调是导致脓毒症所致ARDS的病理基础。其次,关于脓毒症致ARDS的另一主要病理基础是PVEC过度凋亡,造成肺血管内皮损伤。PVEC是帮助保持肺组织完整的重要屏障[11],其分泌的多种介质(TNF,VEGF,ET-1,PGI-2,NO等)可激活炎症反应、加速EC膜表达黏附分子、增强促凝血途径、还可以造成肺泡-毛细血管屏障的改变[12]。通过以上途径引发肺实质的损伤,出现不可逆的急性呼吸窘迫综合征。在ARDS患者的肺部超微结构中可观察到内皮细胞的凋亡和坏死[13]。

二、组蛋白乙酰化概述

HAT和HDAC在气道中广泛表达,它们分别调节组蛋白乙酰化和去乙酰化[14]。一般情况下,HAT与HDAC处于动态平衡中,一旦失衡,将会促进炎症、肿瘤、代谢紊乱等多种疾病的发展[15-16]。脱氧核糖核酸和组蛋白是染色质的主要组成部分,染色质的紧密结构是靠正负电荷的互相吸引。组蛋白乙酰化发生时,HAT将乙酰辅酶A(CoA)的乙酰基转移到组蛋白N端赖氨酸残基上,带负电荷的乙酰基与带正电荷的赖氨酸残基互相结合,造成组蛋白和DNA连接疏松,以增强 DNA的转录[17-18];与HAT作用相反,HDAC可将赖氨酸残基上乙酰基去除,促使DNA和组蛋白紧密结合,导致染色质结构致密,从而抑制DNA的转录。真核生物中已经发现18种HDAC,根据不同同源基因和结构域被分为4大类:Ⅰ类(与Rpd3同源的HDAC1、2、3和8)、Ⅱ类(与HDA1同源的HDAC 4、5、6、7、9和10)、Ⅲ类 (与SIR2同源的SIR1、2、3、4、5、6和7)和Ⅳ类(HDAC11)[19]。而Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅳ类是Zn2+依赖性脱乙酰化酶。

三、HDAC6与脓毒症致ARDS

1 HDAC6结构组织和亚细胞定位

HDAC6蛋白由1215个氨基酸组成,是HDACs家族中最大也是最独特的一员。首先,其定位特殊:绝大部分HDAC酶只定位在细胞核,而HDAC6功能域的核输出信号(nuclear export signal,NES)和丝氨酸-谷氨酸的四肽基序(SE14)使其也可稳定存在于细胞质中。并且,当细胞增殖停止时,核定位信号(nuclear localization signal,NLS)将一部分蛋白质移位到细胞核中,这使HDAC6具有更强的脱乙酰能力[20]。其次,其结构特殊:HDAC6是唯一含有两个完整催化结构域(DD1和DD2)的HDACs,并且这两个同源脱乙酰酶结构域可独立地对HDAC6蛋白的整体活性起作用。位于羧基末端的锌指结构域(ZnF-UBP结构域,也称为BUZ)可与游离泛素以及单体泛素和多聚泛素蛋白高亲和力结合。因此,HDAC6至少在两种细胞信号通路的交叉点上起作用,包括依赖于DD1和DD2的去乙酰化酶作用和依赖于BUZ的泛素结合功能(见图1)[21-22]。

图1 HDAC6的功能结构域示意图

2 HDAC6的生理作用

HDAC6可通过催化多种底物的去乙酰化而表现出不同的功能,而在体内更倾向于表现为非组蛋白酶活性。DD1和DD2通过将α-tubulin、Cortactin、HSP90、Ku70和过氧化物还原蛋白(peroxiredoxin Ⅰ and Ⅱ,Prx Ⅰ/Ⅱ)等多种非组蛋白酶活性底物脱去酰基而参与细胞的增殖、迁移和死亡、免疫反应、转录、错误折叠蛋白的降解和应激反应等[23]。这些生理作用主要受细胞骨架动力学的控制,细胞骨架由微管(MT)、中间丝(由纤维蛋白组成)和丝状肌动蛋白(球状f-肌动蛋白聚合物或g-肌动蛋白)组成。α-tubulin是第一个被证实的 HDAC6 去乙酰化底物,其可逆的乙酰化水平与MT的稳定性和功能密切相关。例如:HDAC6在哺乳动物细胞中的过表达会导致MT蛋白处于低乙酰化水平,并促进趋化性细胞运动;相反,抑制HDAC6功能会使MT蛋白超乙酰化,抑制成纤维细胞的活力[20]。

肌动蛋白(actin)的聚合和交联是由皮质肌动蛋白(Cortactin)促进的。Cortactin可在其F-actin结合重复序列内被p300/CBP相关因子(PCAF)乙酰化,F-actin的形成促进了自噬体-溶酶体融合和底物降解。因此,HDAC6不仅可调节MT细胞骨架,也可调节肌动蛋白,而这也是维持血管内皮屏障稳定的重要组成部分[24-25]。

HDAC6一般通过激活自噬-溶酶体途径(ALP)的发生、促进蛋白质聚集体的形成、介导分子伴侣HSP90的活化三种途径参与错误折叠蛋白的降解[26-28],蛋白质聚集体中的泛素会招募 HDAC6,从而促进依赖Cortactin的F-actin重塑和随后的自噬体-溶酶体融合[28];此外,HSP90的乙酰化会使分子伴侣的活性丧失从而导致其结合蛋白质被降解。

Ku70是一种可在非同源末端连接 DNA 修复中结合 DNA 双链断裂的核因子,HDAC6调控其与促凋亡Bax蛋白(Bc1-2相关X蛋白)相互作用。当Ku70被乙酰化时,它不再与Bax相互作用,Bax随后激活细胞凋亡。此外,HDAC6还参与PI3K/AKT/ERK信号通路,HDAC6的下调会抑制AKT和ERK去磷酸化从而抑制细胞增殖与分化,诱导细胞死亡[29]。

HDAC6在调控H2O2相关压力所引起的细胞反应中扮演重要角色。HDAC6是氧化还原调节蛋白、过氧化还原蛋白Prx Ⅰ和 Prx Ⅱ的特异性脱乙酰酶。当HDAC6被抑制时,乙酰化的 Prxs 聚集,Prx 的乙酰化增加了H2O2还原活性及超氧化物抗性[30]。

因此,HDAC6与上述反应途径蛋白相互作用为它们在疾病病理和生理机制层面上提供了治疗靶点。

3 HDAC6抑制可改善脓毒症致ARDS

目前认为,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACIs)本质上是固有免疫细胞中关键免疫受体表达和抗菌作用的负性调节因子,可以降低巨噬细胞对细菌的吞噬和杀伤作用,提高机体对非严重感染的易感性。当机体发生脓毒症和脓毒症休克等严重感染时,HDACIs 可以保护肺组织细胞免受致命性的炎症损伤。Tubastatin A 是迄今为止最有效的 HDAC6 抑制剂[31]。HDACIs 对脓毒症及相关肺损伤的保护作用可能通过以下途径实现。

(1)HDAC6抑制可减轻肺部炎症反应

脓毒症早期的特点是过度的炎症反应,导致“细胞因子风暴”。这种细胞因子风暴之后是一段长时间的相对免疫抑制。这两个阶段都会增加脓毒症的死亡率。炎症过程始于嗜中性粒细胞的流入,随后是单核细胞的募集,然后单核细胞分化成炎性巨噬细胞或树突状细胞。这些细胞是炎症部位的关键效应细胞,识别并吞噬病原体和坏死细胞以帮助消除感染。中性粒细胞和巨噬细胞的激活同为ARDS 免疫及炎症反应的病理标志。

HDAC6抑制可以阻断炎症信号通路并减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺部炎症[32]。Rosenjack等[33]对LPS 诱导脓毒症小鼠的研究发现,抑制HDAC6后,小鼠肺泡灌洗液中的中性粒细胞百分比显著降低,且恢复MT乙酰化、细胞内运输并减少炎症信号传导。Zhang L.等[34]通过盲肠结扎穿孔 (CLP) 诱导的脓毒症小鼠模型发现,与未经HDACIs预处理的空白组小鼠相比,HDACIs组小鼠肺组织的中性粒细胞浸润减少、血浆 IL-6水平降低、肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平下降,ICAM-1和 E-选择素的表达显著减少; CLP 小鼠的存活时间显著延长,脓毒症所致肺损伤显著减轻。Zhang W.B.等[35]研究后发现,HDAC6抑制剂可阻断 ROS 的过量产生,并抑制LPS 激活的巨噬细胞中促炎细胞因子如 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的表达。核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)在抑制ROS诱导的炎症反应中起重要作用[36]。Nrf2可以调节其下游相关靶基因血红素氧合酶-1(HO-1)以发挥其抗氧化应激的作用。此外,HO-1的表达可以抑制促炎细胞因子在巨噬细胞中的产生[37]。Thangavel等[38]发现,在LPS诱导的脓毒症小鼠模型早期,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Trichostatin A,TSA)和DNA甲基化酶抑制剂(5-Aza 2-deoxycytidine,Aza)的联合预处理可减少肺组织炎症并促进M2型巨噬细胞极化,提高抗炎反应。由此可见,与炎性反应有关的转录因子、细胞内信号分子、细胞因子受体等均受到乙酰化调节,因而HDACIs可影响炎症性疾病的发生发展,为脓毒症致ARDS的治疗提供了一条新的途径。

(2)HDAC6抑制可降低脓毒症诱导的内皮细胞高渗透性

内皮屏障功能障碍是一种血管对炎症的反应,会导致血管通透性增加,血管内外液体交换失衡,它的功能障碍可导致富蛋白质水肿的发生,常伴随发生于ARDS[39]。MT、肌动蛋白细胞骨架和细胞间连接(粘着连接AJ,紧密连接TJ)是维持内皮屏障完整性所需的关键成分。MT结构的主要蛋白组成成分为α-和 β-tubulin,HDAC6介导的tubulin去乙酰化会导致MT解聚,稳定性降低,而通过抑制HDAC6增强tubulin乙酰化可降低脓毒症诱导的内皮屏障高通透性[40]。诺考达唑是一种MT去稳定剂,可以在肺血管内皮细胞中诱导产生内皮细胞屏障功能障碍;而使用MT稳定剂紫杉醇的静脉内给药可改善 EBD 和LPS致肺损伤所产生的炎症[41]。

此外,MT与肌动蛋白细胞骨架的相互作用在调节内皮通透性方面也发挥着积极作用。Rho是MT和肌动蛋白骨架之间的信号传导中间体,通过抑制HDAC6可下调Hsp90 依赖性RhoA 活性和信号传导,然后通过抑制肌动蛋白细胞骨架重组和细胞收缩改变内皮通透性[42]。

AJ是细胞间连接的重要组成部分,在维持细胞屏障完整性也发挥着重要作用。VE-cadherin蛋白和β-catenin蛋白是 AJ 复合物的两个主要成分。β-catenin 蛋白在细胞-细胞连接处与VE-cadherin相互作用,以支持内皮屏障完整性。β-catenin去乙酰化会诱导β-catenin核转位和 AJ 的解聚,而抑制 HDAC6 可恢复 β-catenin 乙酰化来降低脓毒症诱导的内皮屏障高渗透性[43]。

半胱天冬酶(Caspases)的激活在内皮细胞屏障功能障碍发生过程中也起着重要作用。其主要机制包括介导细胞凋亡和改变细胞连接蛋白如ZO-1和VE-cadherin排序。MT破坏会导致凋亡信号传导和Caspases激活增加。抑制Caspases可有效减轻脓毒症致ARDS小鼠模型的肺部损伤[44]。

目前,有多项研究证明HDAC6抑制可有效减轻肺内皮细胞屏障功能障碍。Thangavel等[45]研究表明,在 LPS 诱导的小鼠ARDS模型中,TSA的干预可降低死亡率并改善肺血管内皮细胞的完整性。Joshi等[42]提出HDAC6 抑制剂通过抑制 Hsp90 依赖性 RhoA活性和信号传导,可减轻与 LPS 诱导的小鼠 ARDS 相关的炎症、毛细血管通透性和结构异常。Yu等[46]观察到与对照组相比,用HDAC6抑制剂预处理组的脓毒症小鼠肺血管内皮细胞连接蛋白表达改善,肺水肿减轻。综上,HDAC6抑制是一种可以调节炎症性肺损伤中内皮细胞连接稳定性的新方法。

(3) HDAC调控miRNA参与脓毒症诱导的ARDS

miRNA 是一组进化上保守的小型内源性非编码 RNA,它们通过对其靶转录物的序列特异性识别来协调哺乳动物基因的表达。miRNA 参与许多病理生理过程,例如调节细胞增殖、分化、凋亡、代谢和免疫反应。

近年来研究发现,miRNA 与肺部疾病的发生发展和预后密切相关,包括肺炎、肺癌、肺纤维化等[47]。在ARDS 中,miRNA 可以通过靶向特定分子来调节炎症和免疫反应[48-49]。目前与促炎相关的 miRNA 主要有miR-34a、miR-132、miR-155、miR-15a、miR-21、miR-27b和miR-146a等。脓毒症合并ARDS患者血浆中miR-155的表达明显高于脓毒症但未合并ARDS的患者。脓毒症合并ARDS患者的miR-155水平与IL-1β和TNF-α水平及ARDS评分呈正相关,与PaO2/FiO2呈负相关[50]。Jiang等发现miR-23a-3p升高促进LPS诱导的小鼠巨噬细胞M1极化,而抑制miR-23a-3p会导致巨噬细胞反应降低并改善肺部炎症[51]。越来越多的证据表明,miRNA 在与血管生物学功能相关的多个生物学过程中发挥着重要作用,例如血管生成、内皮细胞功能和血管炎症[52]。此外,Xu等[53]从小鼠骨髓基质干细胞 (BMSCs) 中分离出外泌体,使用LPS建立小鼠肺部炎症模型,结果发现外泌体和miR-150减轻了炎症和肺水肿,同时保持了肺泡结构的完整性;它们还可通过调节caspase-3、Bax/Bcl-2和MAPK信号传导来减轻微血管内皮细胞损伤。小细胞外囊泡(sEV)治疗会抑制肺血管内皮细胞凋亡,Li等[54]发现不止一种miRNA在调节sEV减轻 LPS 诱导的内皮屏障损伤方面发挥作用。

HDAC6与 miRNA 关系密切。Wildung 等[55]通过建立小鼠ARDS模型观察纤毛相关基因与 miR449-/-表达变化的研究发现,用HDAC6 抑制剂处理的miR449-/-细胞具有更多和更长的呼吸纤毛,提示 HDACIs 可影响 miRNA 的表达。Li等[56]研究表明,Tubacin可增强DNM3os/miR-199a2 轴的表达,具有降低缺氧诱导因子(HIF-1α)和肺血管内皮细胞中的内皮素-l(ET-l)水平的有益结果。所以,HDAC6所调节的miRNA可能是ARDS 的诊断指标和治疗靶点。

四、小结

ARDS是脓毒症的常见临床并发症,极大地危害着人类健康,在过去十年中,脓毒症疗法的开发取得了一定进展,但死亡率仍然很高。因此,研究包括脓毒症分子机制在内的发病机制对于设计脓毒症预防和治疗策略具有重要意义。HDAC6抑制主要通过抑制炎症信号通道,减少炎症因子的释放来改善脓毒症诱导的ARDS;HDAC6抑制还通过诱导α-tubulin和β-catenin乙酰化、增加β-catenin的膜定位,对其靶底物的影响来保护内皮屏障功能,从而导致MT和AJs的稳定;它还可以防止caspase-3活化,维持肺内皮细胞-细胞连接,抑制肌动蛋白应力纤维形成,并通过调节HSP90降低肌球蛋白轻链的磷酸化。此外,许多研究表明增加保护性miRNA的表达和抑制不利的miRNA可有效缓解ARDS,一些miRNA还被证明是ARDS的生物标志物。而HDACIs可通过miRNAs发挥其抗炎及抗凋亡作用。这些发现均支持HDAC6抑制是一种预防器官衰竭和改善脓毒症预后的新型治疗靶点。