参附对大鼠心肺复苏术后肺损伤的保护作用及其机制的探究

陆辉志 李伟,2

在我国,随着老龄化进程的加快以及人均寿命的延长,心血管疾病的发病率逐年上升,而心血管疾病最严重的后果为心脏骤停(cardiac arrest,CA)。CA患者即使在早期接受了有效的心肺复苏(cardio-pulmonary resuscitation,CPR)治疗并恢复了自主循环,最终能够存活并出院的患者微乎其微[1]。CPR术后患者死亡通常是由于缺血/再灌注损伤引起的重要脏器衰竭,如心脏、大脑、肾或其他重要器官,而复苏后肺水肿、呼吸衰竭是最常见的并发症之一。

既往的研究表明,在休克及复苏期间,参附注射液治疗可以提升血压,改善微循环,有助于减轻全身炎症反应,进而减轻重要器官的缺血再灌注损伤[2]。此外,尚有报道显示,参附注射液还具有一定的抗凋亡作用[3]。本研究通过构建CA模型,探讨参附注射液对心肺复苏术后肺损伤的保护作用及相关机制。

资料与方法

一、实验材料

IGF-1:上海肯强贸易有限公司;TNF-α,IL-1β及IL-6 ELISA检测试剂盒:武汉博士德生物技术有限公司;MDA及SOD检测试剂盒:武汉博士德生物技术有限公司;一抗NF-κB-p65抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、GAPDH抗体及二抗山羊抗兔IgG均购自美国CST公司;多功能自动酶标仪购自美国Molecular Devices公司;高速台式离心机购自美国Beckman公司;Western Blot仪器购自美国Bio-Rad公司;水浴恒温摇床(SHY-2,江苏),紫外分光光度计(CE 2041,英国),呼吸机(HX-200)及BL-420E+生物机能试验系统(泰蒙公司,成都)。

二、实验对象及方法

生产教育是1930年代初，尤其是1931年全国性大水灾及“九·一八”事变后内忧外患背景下，政府当局与教育界上下呼应、合力提倡的教育主张，意在通过教育授予受教者生产技能，为社会生产事业提供技术人才，推动国民经济的发展。教育史家舒新城认为，此时期中国教育思想的主要内容已“由治术教育转变到生产教育”[1]。教育界关于生产教育的讨论中，围绕“生产”究竟是以农业生产还是工业生产为主，先后形成“农业为主”论、“工业为主”论以及“农工并重”论等三派观点。

结果显示，吸烟成瘾组的男性比例高于其他两组，网络成瘾组的女性比例高于其他两组(χ2=29.066，P＜0.05)，3组被试在性别上差异有统计学意义。但在年级、民族、是否为独生子女以及家庭所在地上比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

四、参附减轻CPR术后肺组织细胞凋亡水平并抑制炎症反应通路的激活

四、统计学处理

为了确保整个课堂教学都是有效的，在课前需要做好相应的准备工作，应该提前将和教学内容相关的素材全部准备好，只有这样才可以提高本课程教学的有效性。一方面是教师准备，精心规划课本的重点、难点、学习目标、问题设计以及学生实际情况等等，真正做到心中有数，为确保教学活动的正常进行奠定坚实的基础。另外一方面是学生准备，首先应该整体感知课本内容，对本课程内容有初步的认识，找到其中的疑惑，进而在学习过程中得到高效的解决，促使课堂学习得到正常开展。

复苏后24小时,2%戊巴比妥钠过量麻醉大鼠,采集血液和肺组织。采集的血液在4℃下以3000 g离心20 min,收集上清液并储存在-80℃冰箱直至测定。将部分肺组织用10%中性甲醛溶液固定后用于病理学分析,剩余的肺组织在液氮中快速冷冻并储存在-80℃冰箱直至测定。

三、检测指标

浙江省文联党组书记、副主席、书记处常务书记田宇原，中国文联副主席、浙江省文联主席、浙江省美术家协会主席许江，团省委副书记、浙江省青联副主席周苏红，浙江省文联党组成员、书记处书记徐晓等领导，全山石、高士明、吴山明、邬继德、孙永、应金飞、尉晓榕、杨参军、张曙光、井士剑、孔国桥、杨劲松、周崇涨等知名美术家出席开幕式。浙江省美术家协会副主席兼秘书长骆献跃主持开幕仪式，周蕴智、全山石、孙永、许江分别代表青年美展作者、老一辈美术家、展览评委会和主办方先后致辞。

1 肺组织病理学分析 肺组织经甲醛固定,石蜡包埋后切片。脱蜡、脱水后苏木精、伊红染色,在光学显微镜下观察组织学特征。主要观测指标为肺泡壁厚度、血管充血、肺泡内渗出及肺间质炎细胞浸润。每个组织学特征按无损伤、轻度损伤、中度损伤至重度损伤4个等级进行评分:0～3分,将4个组织学特征的评分相加即为急性肺损伤(ALI)评分。

2 湿/干重比值测定 取适量肺组织,用吸水纸吸干后称重,即湿重;然后将其放入110℃烤箱中,烘烤24 h后再次称重,即干重。计算湿重与干重的比值。

3 血清炎症因子测定 采用ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程公司)测定血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的含量。用酶标仪进行检测,以吸光度值计算浓度,结果表示为pg/mL。

4 肺组织氧化应激指标测定 取适量肺组织,加入适量的生理盐水和蛋白酶抑制剂,超声波破碎仪研磨匀浆,离心后取上清,按照试剂盒说明书(武汉博士德生物工程公司),采用比色法检测肺组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及SOD 活性。

5 Western Blot分析 取适量肺组织,按比例加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂,超声波破碎仪研磨匀浆,4℃ 12000 g离心5 min,取上清液,BCA法测蛋白浓度,以30ug蛋白上样量计算上样体积。加上样缓冲液后煮沸10 min使蛋白变性。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转移蛋白至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭2 h,加入一抗Bcl-2(1∶1000,CST公司)、Bax (1∶1000,CST公司)、磷酸化的NF-κB P65(1∶1000,CST公司)及GAPDH(1∶1000,CST公司),4℃孵育过夜。TBST洗膜(10 min×3次),加入相对应的二抗山羊抗兔IgG(1∶3000,CST公司),室温孵育1 h,ECL试剂发光显色,拍照,Image J软件分析测定条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,仰卧位固定,标准肢体导联监测心电。气管切开插管;分离右颈动脉,接多导心电监护仪监测平均动脉压(mean arterial pressure,MAP);分离右侧股静脉,24号留置针穿刺置管,肝素封管备用。所有插管完成后稳定15 min,通过窒息法诱导CA[4]:于呼气末夹闭气管导管直至大鼠心脏停搏。心脏停搏的观测标准为:心电图显示心电静止、室颤、电机械分离;心尖区心脏搏动消失或MAP低于20 mmHg。心搏停止6 min后开始心肺复苏,以食指按压胸部,200次/min;同时恢复机械通气,呼吸频率为50次/min,潮气量6 mL/kg,吸氧浓度100%;经股静脉注射肾上腺素(0.01 mg/kg);如有必要,给予电除颤(5 J)。如第一次除颤后不能恢复自主心跳,则在30 s后重复一次。CPR成功标准:心电图出现正常的QRS波群、可触及到明显的心脏搏动或MAP升至60 mmHg以上。如心肺复苏5 min未成功,则停止复苏,宣告死亡。在复苏成功后,按分组给予不同的干预措施,CPR+SF组经股静脉置管给予1 mL/kg的参附注射液,CPR组给予等同剂量的生理盐水。Sham组及Sham+SF组只置管,不诱导心脏停搏,不复苏,在对应的时间点按分组进行干预。给药后继续进行6 h的生命支持治疗,然后拔除所有导管,大鼠归笼,持续观察至复苏后24 h。

经过混凝沉淀工艺后，水厂A和B中均无MK检出。而水厂A和B的混凝沉淀工艺对HHCB的去除率分别为65.09%和28.53%，对AHTN的去除率分别为31.00%和27.75%。这可能是由于水厂A和B在混凝池与沉淀池的形状上有所不同，相比于水厂B采用的网格混凝池和斜管沉淀池，水厂A采用的折板混凝池和平流沉淀可能更加利于对HHCB与AHTN的去除。在A厂中，水流通过折板之间速度一般沿程减小，相对B厂水流条件可能比较稳定，絮凝时间较长，对HHCB与AHTN等易吸附于颗粒表面的有机物，混凝效果更好。然而，混凝效果与混凝池设计、原水等多方面因素有关，可在后续研究中进一步探索。

结 果

一、参附减轻大鼠CPR术后肺损伤

体积随压力的变化关系由三阶Brich-Murnaghan方程拟合，其中三阶Brich-Murnaghan方程表示为[19]：

四组大鼠肺组织病理学分析显示,Sham组及Sham+SF组大鼠肺泡壁光滑完整,少见断裂;肺泡间隔均匀一致,无明显增厚;血管无充血;肺泡腔及肺泡间隔内少见中性粒细胞浸润,ALI评分均为轻度损伤[Sham组:(1.58±0.39)分;Sham+SF组:(1.72±0.30)分]。CPR组可见肺泡壁断裂,肺泡间隔明显增厚,肺泡腔中可见渗出及炎性细胞浸润,部分肺泡萎陷不张,ALI评分显示为中至重度损伤[Sham组(1.58±0.39 )分vsCPR组(6.88±0.77)分,P<0.001]。参附注射液治疗后肺组织充血水肿及炎细胞浸润减少,肺损伤评分为轻中度损伤,与CPR组之间差异有统计学意义[CPR组 (6.88±0.77) 分vsCPR+SF组(5.31±0.70)分,P<0.001](如图1 A,B)

肺组织湿/干重比值测定表明,与Sham组相比,CPR组及CPR+SF组湿/干重比值显著升高[Sham组(3.69±0.23)vsCPR组(5.39±0.47),P<0.001; Sham组(3.69±0.23)vsCPR+SF组(4.82±0.40),P<0.001],而CPR+SF组较CPR组明显下降[CPR组(5.39±0.47)vsCPR+SF组(4.82±0.40),P=0.002],差异有统计学意义(如图1C)。

血清炎症因子测定结果显示,Sham组及Sham+SF组血清炎症因子含量较低,与Sham组相比,CPR组及CPR+SF组血清炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6含量均显著升高。而参附干预后,三种血清炎症因子浓度均有不同程度下降[TNF-α:CPR组(408.33±30.74)pg/mLvsCPR+SF组(312.11±41.27)pg/mL,P<0.001;IL-1β:CPR组(100.67±8.51)pg/mLvsCPR+SF组(69.33±9.11)pg/mL,P<0.001;IL-6:CPR组(316.11±29.54) pg/mLvsCPR+SF组(223.11±22.94)pg/mL,P<0.001],差异有统计学意义(如图2)。

二、参附抑制CPR术后全身炎症反应

图2 各组大鼠血清炎症因子TNF-α,IL-1β及IL-6含量比较 A:四组大鼠血清TNF-α含量比较;B:四组大鼠血清IL-1β含量比较;C:四组大鼠血清IL-6含量比较。与Sham组相比,*P<0.05;与CPR组相比,#P<0.05(n=9)

三、参附减轻CPR术后肺组织氧化应激损伤

肺组织MDA含量及SOD活性检测表明,Sham组及Sham+SF组MDA含量较低,SOD活性较高,而CPR组及CPR+SF组MDA含量显著增加,SOD活性明显下降。与CPR组相比,SF治疗后MDA含量下降[CPR组(98.00±5.74)μmol/gvsCPR+SF组(84.56±5.88)μmol/g,P<0.001],SOD活性则增加[CPR组(13.56±3.75)u/gvsCPR+SF组(20.44±3.91)u/g,P=0.002],差异有统计学意义(如图3)。

图3 各组大鼠肺组织氧化应激损伤比较 A:四组大鼠肺组织MDA含量比较;B:四组大鼠肺组织SOD活性比较。与Sham组相比,*P<0.05;与CPR组相比,#P<0.05(n=9)

36只清洁级雄性成年SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限公司,SCXK(沪)2017-0012),体重250～300 g,随机分为4组(n=9):假手术组(Sham组),Sham+参附注射液治疗组(Sham+SF组),心肺复苏组(CPR组),CPR+参附注射液治疗组(CPR+SF组)。相关动物实验内容已通过动物实验伦理委员会审查(武三医实伦 SY2021-024),动物饲养在温度、湿度相对恒定的SPF级动物房内[温度(24±2)℃、湿度(55±5)%],12 h昼夜交替,自由进食水,术前禁食水8 h。

四组大鼠肺组织Western Blot检测结果显示:Sham组抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平较高,凋亡蛋白Bax及磷酸化NF-κB-P65(P-P65)表达水平较低;与Sham组相比,CPR组及CPR+SF组Bcl-2表达水平下调,Bax及P-P65的表达量增加。而与CPR组相比,SF干预促进了Bcl-2的表达[CPR组(0.62±0.09)vsCPR+SF组(0.87±0.10),P<0.001],并显著抑制了Bax[CPR组(0.84±0.06)vsCPR+SF组(0.54±0.07),P<0.001]及P-P65[CPR组(0.96±0.07)vsCPR+SF组(0.71±0.06),P<0.001]的表达(如图4)。

2.2.6 家乡经济条件 一般家乡经济条件对劳动力外出务工意愿既有正向影响，又有负向影响。一方面，较好的家乡经济条件能够给农村劳动力更宽的视野，使其渴望外出获得更好的就业机会；另一方面，较好的家乡经济条件可能有较好的就业机会，降低其外出务工意愿。调查中，经济条件较差的编码为1，有44名，占22.9%；经济条件一般的编码为2，有92名，占47.9%；经济条件较好的编码为3，有56名，占29.2%。

平时教学中，总能发现，问题一提出，几乎全班学生都举手发言，看似流畅，实则说明问题的难度太低，学生思考的空间很小。课堂上为了促进学生深度思考，教师要提出对学生有挑战性的问题。北京市特级教师张红，在一次讲座中提到教师要善于提出“胖”问题，也就是能够引起学生发散思维和深度思考的问题。针对“正比例的意义”这节课，核心问题是找到“呈正比例的两个量”有什么特征。这是个大问题，需要学生综合分析变化情境，通过分析归类，不断抽丝剥茧，才能抽象出“正比例”的内涵。所以这个问题是一个有深度、对学生来说有挑战的问题，能引起学生的深度思考。

图4 各组大鼠肺组织凋亡蛋白及磷酸化NF-κB-P65表达水平比较 A:四组大鼠肺组织Bcl-2、Bax、P-P65蛋白条带图,B,C,D:Bcl-2、Bax、P-P65相对表达量,与Sham组相比,*P<0.05,与CPR组相比;#P<0.05(n=9)

讨 论

本实验通过构建大鼠CA模型,检测肺组织病理改变、含水量、氧化应激损伤,以及血清炎症因子含量、肺组织凋亡蛋白与炎症蛋白表达水平,证明了参附注射液对CPR术后肺损伤具有保护作用,其机制可能与抗炎症反应及抗凋亡有关。

随着CPR技术的普及,越来越多的CA患者能够及时的接受CPR治疗,自主循环恢复的比例也有所提升,但最终存活下来并顺利出院的患者却并不多见[1],其中部分患者还遗留有严重的神经功能障碍及其他并发症。复苏后患者死亡的原因主要是由于全身缺血再灌注引起的心脏骤停后综合征,而肺损伤是心脏骤停综合征的一个重要表现[5]。

据统计,CPR术后肺损伤的发生率高达20%以上[5],它的出现与复苏后患者死亡密切相关[6]。CPR术后肺损伤的致病机制极其复杂,目前尚未完全明确,已知的损伤因素包括机械损伤、吸入性损伤以及缺血再灌注损伤。机械损伤即胸部按压直接导致的肺泡毛细血管膜破裂,引起肺出血和水肿。吸入性损伤是指复苏过程中胃内容物的返流及口咽部分泌物误吸导致的损伤。缺血再灌注损伤是复苏后肺损伤最主要的致病机制,心脏停搏后组织缺氧、细胞内自由基生成增多,引起氧化应激损伤及内皮细胞功能障碍,在自主循环恢复后诱发再灌注损伤[6]。

缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程,涉及氧化应激反应、炎症反应和细胞凋亡。心脏停搏后,全身组织器官缺血缺氧,氧化应激反应加重,活性氧介质(reactive oxygen species,ROS)蓄积,进而诱导内皮细胞活化、促进细胞因子分泌并激活循环中的中性粒细胞。在自主循环恢复以后,活化的中性粒细胞引起局部及全身的炎症反应,与此同时,大量的促炎细胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6以及转录因子,包括NF-κ B迅速释放,进一步加剧组织损伤[7]。此外,心脏停搏后机体内在抗氧化能力下降,加之大量的ROS蓄积,势必破坏必要的细胞成分,最终不可避免地导致细胞凋亡[8]。

本实验结果显示,CPR组大鼠在自主循环恢复以后,肺组织出现中至重度的病理损伤,主要表现为部分肺泡壁断裂,肺泡间隔增宽,肺间质内炎性细胞浸润,肺泡内充血,肺组织含水量亦明显增加。由此证明,复苏后肺损伤的存在。此外,在复苏以后,CPR组大鼠肺组织MDA含量显著增加,SOD活性明显下降,血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著上升,肺组织中磷酸化的NF-κ B P65表达量增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降,而凋亡蛋白Bax水平明显上调,提示肺组织氧化应激损伤加重,出现了一定程度的全身炎症反应,肺组织内的炎症反应通路激活,并伴随有细胞凋亡。所得结果与先前的研究基本一致,而参附注射液治疗后,大鼠肺组织病理损伤程度减轻,含水量明显下降,氧化应激损伤减轻,表明参附注射液对CPR大鼠肺损伤具有一定的保护作用。

从本质上来说，乡村原生态旅游就是将自然环境作为基础，在无社会破坏及干扰的情况下，促进乡村经济发展，实现我国社会经济可持续发展。在乡村旅游事业迅速发展的背景下，我国逐渐加强了对乡村旅游资源的开发及利用，当地居民的生活用水显著增加，且污水处理系统缺乏完善性，导致大量的生活污水难以得到及时处理，进而流入自然河流中，对河流湖泊等水环境造成较大的破坏及污染，不仅影响游客旅游过程的体验，也威胁到我国乡村原生态旅游环境的可持续发展［1］。

参附注射液已广泛应用于临床多年,先前的研究表明,参附注射液可以阻断炎症反应的恶性循环,改善全身微循环状态并延长缺氧耐受时间。在改善心输出量、组织再灌注及氧代谢,以及降低全身血管阻力、肺动脉压力及肺毛细血管楔压方面,参附注射液的作用均优于多巴胺[9]。在感染性休克模型中,参附注射液可下调HMGB1的表达、移位及分泌,进而抑制HMGB1介导的NF-κB通路活化,最终阻断下游的炎症因子释放[10]。在肺缺血再灌注损伤模型中,参附注射液治疗可降低大鼠肺组织含水量及支气管肺泡灌洗液中总蛋白的含量,抑制炎症反应及肺组织脂质过氧化损伤,发挥一定的肺保护作用[2]。在失血性休克模型、脓毒症模型及心肺复苏模型中,参附注射液均可通过抑制细胞凋亡减轻多种器官的损伤[3,11-12]。本实验观察到,心肺复苏过程中,参附注射液治疗后,大鼠血清炎症因子含量显著下降,磷酸化的NF-κ B表达水平下调,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加,而凋亡蛋白Bax的表达下降。由此证明,参附注射液对CPR大鼠肺损伤的保护作用与抗炎、抗凋亡作用有关。

综上所述,本研究表明,在心肺复苏中,参附注射液治疗,可减轻CPR术后肺损伤,其机制可能与抑制炎症反应及细胞凋亡有关。