川芎嗪对脂多糖诱导的小鼠ALI血管通透性的影响及相关分子机制研究

刘小碣 薛蕾 闵思敏 高可飞 陶伟婷 李言 张永,2

急性肺损伤 (acute lung injury,ALI)是导致机体出现以低氧血症和呼吸窘迫为主要表现的临床综合征,炎症反应等致病因素导致的血管内皮功能障碍及血管通透性增加是ALI的发病机制之一[1-2],而细胞骨架的改变影响内皮细胞形态和功能[3]。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是从中药川芎中提取得到的生物活性碱,具有改善微循环的作用,可能影响ALI发病中血管内皮功能[4-5]。mTOR (mammalian target of rapamycin) 是一种丝/苏氨酸激酶,可调节细胞代谢[6],mTOR对GTP酶家族蛋白RhoA有调节作用[7],RhoA作为分子开关与细胞因子结合并通过ROCK信号级联调节细胞骨架从而影响细胞的形态[8]。本研究将通过观察TMP对小鼠肺血管内皮通透性的影响并探讨其中参与调节细胞骨架功能信号通路的作用机制,为ALI临床治疗提供理论参考依据。

资料与方法

一、材料

1 实验动物来源

选择SPF级6～8周龄雄性C57BL/6小鼠,饲养于蚌埠医学院心脑血管疾病基础与临床重点实验室的动物房内。动物房内全天温度保持在21℃～25℃之间;空气湿度为40%～70%;保持良好的通风;日间光照强度为100 Lux,光照周期为12小时光照,12小时黑暗。本研究遵循动物伦理要求[伦动科批字[2016]第015号]。

2 实验器材

低温高速离心机:美国 BECKMAN COULTER 公司;多功能酶标仪:PerkinElmer 公司;电子天平:美国 Mettler Toledo 公司;蔡司荧光倒置显微镜(德国 ZEISS公司);普通倒置相差显微镜:日本奥林巴斯公司;电热鼓风干燥箱:上海一恒科学仪器有限公司;Western Blot 凝胶成像仪:上海天能生命科学有限公司。

3 药品与试剂

脂多糖(lipopo1ysaccharide,LPS):美国 Sigma 公司;磷酸川芎嗪:中国药品生物制品鉴定所;无水乙醇、二甲苯购自武汉赛维尔生物科技有限公司;4%多聚甲醛购自上海碧云天生物技术有限公司;RIPA 裂解液:上海碧云天生物技术有限公司;phosSTOP 磷酸酶抑制剂:瑞士 Roche 公司;PMSF:上海碧云天生物技术有限公司;Tris 粉、SDS 粉、甘氨酸粉:Bioforxx 公司兔抗人 Phospho-mTOR (Ser2448)抗体:美国 CST 公司;兔抗人RhoA抗体(ab187027):美国艾博抗公司。

二、方法

1 C57BL/6小鼠肺损伤模型的建立

选择6-8周龄25g左右小鼠 50只,实验分五组:溶剂对照组(CON组,n=10)、ALI模型组(ALI组,n=10)、川芎嗪低浓度治疗组(TMP-L组,n=10)、川芎嗪中浓度治疗组(TMP-M组,n=10)、川芎嗪高浓度治疗组(TMP-H组,n=10)。川芎嗪低、中、高浓度组分别注射川芎嗪的量为50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg(生理盐水稀释)。ALI模型建立方法采用二次打击法[9]:其中川芎嗪治疗组在首次打击前30 min腹腔注射川芎嗪,第一次打击:向小鼠腹腔内注射2 mg/kg脂多糖(浓度2 mg/mL)。第一次打击结束后12 h进行第二次打击:向小鼠气管内滴注4 mg/kg脂多糖(浓度4 mg/mL)。溶剂对照组用生理盐水替代脂多糖进行打击(注射量和滴注量同前)。川芎嗪治疗组在二次打击30 min后再次腹腔注射相同剂量川芎嗪。造模24 h后将小鼠颈椎脱臼处死并进行相应的取材。

2 小鼠肺组织病理学检查

小鼠处死后打开胸腔剥离肺组织,置于浓度为10%的甲醛中浸泡固定24 h,然后转至75%的酒精中,依次进行脱水、浸蜡、包埋处理,6 μm切片并脱蜡后进行常规苏木精-伊红(HE)染色并在蔡司显微镜下进行肺组织病理学观察。

3 Western Blot检测小鼠肺组织中P-mTOR蛋白和RhoA蛋白表达水平

取各处理组小鼠肺组织于研磨管中,以1:10的比例加入RIPA裂解液混合物,匀浆后离心,取上清蛋白进行电泳分离,转膜,封闭后,将载有目的蛋白的膜放入分别装有P-mTOR(1∶1 000)、RhoA(1∶2 000)、GAPDH(1∶10 000)的抗体中4℃孵育过夜,用Tris-HCl缓冲盐吐温溶液(TBST)洗膜3次,将膜放入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶20 000)中室温孵育2 h,TBST再次洗涤3次,曝光机曝光条带后,使用ImageJ-v1.8.0软件进行灰度值分析。

4 小鼠肺组织湿干重比值

每组取4只小鼠,处死后取出肺组织,用纸巾吸干肺表面的水分后进行称量即为肺组织的湿重(W1),将肺组织放入鼓风干燥箱中60℃烘干48 h至恒重此即为肺组织干重(D1),计算肺组织湿干重比值W/D=W1/D1×100%。

5 小鼠BALF白细胞计数和总蛋白浓度的测定

每组取4只鼠,处死后仰卧于操作台上,固定四肢,从喉部对小鼠行气管切开术并插入气管导管,分3次向肺内注入无菌生理盐水,每次注入0.8 mL,回收肺泡灌洗液,回收率在70%～85%之间,1200 rpm离心10 min,上清用于测蛋白浓度,沉淀加入200 μL红细胞裂解液重悬,后离心弃上清,1 mL PBS重悬沉淀用于细胞计数。测蛋白浓度时吸出样本20 μL加入200 μL BCA溶液,60℃水浴35 min,测OD值并计算蛋白浓度。

6 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α水平

将上面步骤离心后的肺泡灌洗液上清用于检测IL-1β、TNF-α促炎因子的表达量,根据试剂盒说明书步骤进行实验。

7 Evans Blue染色测肺组织通透性

每组取4只小鼠,尾静脉注射Evans Blue溶液(20 mg/kg),一小时后处死,通过心脏将肺血管中的血液冲洗干净,取出肺组织称重后以1:10的比例加入甲酰胺溶液,研磨后置于45℃水浴锅中加热72 h,加热后2 000 rpm离心10 min,去沉淀留上清用酶标仪测溶液吸光度(λ=620 nm),根据标准曲线算出伊文思蓝含量。

8 电子显微镜观察血管内皮细胞紧密连接

每组取3只小鼠处死后快速取肺组织切块,固定、脱水、制片、染色后置于电子显微镜下观察肺微血管内皮细胞处紧密连接结构。

三、统计学分析

结 果

一、低、中、高浓度川芎嗪对ALI模型小鼠肺组织病理的影响

酶联免疫吸附实验(ELISA)检测结果显示ALI模型组小鼠相比较对照组小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α 的表达量升高;在经川芎嗪中浓度(100 mg/kg)治疗后,肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α 的表达量明显降低(见图1)。与对照组比较,ALI模型组小鼠肺组织可见明显炎性细胞浸润及肺泡间隔明显变宽,肺泡间隔及肺间质内有大量炎性细胞浸润,提示造模成功;与模型组比较,中浓度川芎嗪治疗组肺组织病变明显改善,炎性细胞浸润明显减轻,细胞坏死脱落数量明显减少,肺组织细胞结构明显恢复,低、高浓度的川芎嗪对急性肺损伤缓解效果类似但不显著(见图2)。以上两个实验均证明川芎嗪中浓度(100 mg/kg)组治疗效果最为显著,后续探讨川芎嗪对肺血管通透性的保护作用相关实验均选择中浓度川芎嗪进行研究。

图1 肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-ɑ 水平

图2 小鼠肺组织病理学检查结果(HE×200)

二、川芎嗪对肺血管通透性的影响

ALI模型组肺泡灌洗液中比对照组肺泡灌洗液中白细胞数和总蛋白浓度上升,川芎嗪治疗组对比ALI模型组肺泡灌洗液中白细胞计数和蛋白浓度都下降(见图3,4)。川芎嗪药物治疗可显著降低急性肺损伤肺组织湿干比(见图5)。在伊文思蓝实验中,伊文思蓝可以与白蛋白结合,当肺血管渗透性增加时伊文思蓝可以随着白蛋白的渗出而渗出到肺间质,川芎嗪治疗可以明显降低伊文思蓝的渗出(见图6,7)。以上结果均提示川芎嗪可以改善急性肺损伤的血管渗漏作用。

图3 小鼠肺泡灌洗液白细胞计数

图4 小鼠肺泡灌洗液总蛋白浓度测定

图5 各组小鼠肺组织湿干比

图6 小鼠肺组织蓝染后大体标本

图7 肺组织Evans Blue 浓度值测定

三、川芎嗪干预对ALI小鼠肺组织中mTOR/RhoA信号通路的影响

Western Blot检测P-mTOR、RhoA蛋白表达水平,P-mTOR是mTOR的活性形式,P-mTOR蛋白表达量的增加提示mTOR/RhoA通路被激活。WB实验结果表明川芎嗪可以降低P-mTOR的表达量(见图8)从而降低RhoA蛋白的表达水平(见图9)。所以川芎嗪可以通过影响mTOR/RhoA信号通路改变细胞骨架,减轻肺血管通透性。

图8 各组小鼠肺组织中P-mTOR表达水平

图9 各组小鼠肺组织中RhoA表达水平

四、川芎嗪可改善肺血管内皮间紧密连接

上述结果均表明川芎嗪可以降低肺血管通透性,通过电镜可观察到LPS可使血管内皮细胞连接断裂受损,血管内皮细胞的连接断裂可造成血管通透性增加,川芎嗪治疗后可改善被损伤的血管内细胞连接,从而降低血管通透性(见图10)。

图10 电镜下小鼠肺血管内皮细胞紧密连接结构(×10 000)

讨 论

急性肺损伤(ALI)曾被认为是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)早期阶段(临床上称为ARDS),是发病率、死亡率很高的呼吸窘迫为特征的急性进展的呼吸衰竭[10]。它的病理特点是顽固的低氧血症、双侧肺弥漫性浸润、肺水肿、肺顺应性下降和功能残气量下降[11]。在 ALI的病理过程中,肺血管内皮细胞是最先暴露于病理刺激的细胞,肺血管内皮细胞在肺组织发育、肺组织免疫以及维持肺血管张力和屏障完整性中起关键作用。肺血管内皮损伤、肺泡-毛细血管屏障通透性增加导致蛋白质和富含炎性细胞的液体流入肺泡腔、肺泡-毛细血管屏障之间的气体交换减弱和炎症失调是ALI发生和进展的关键环节[12]。本研究通过脂多糖“二次打击”建立ALI模型,“二次打击”模式与临床环境相关,在第一次打击引发初次炎症后,患者在适当的时候更容易受到二次打击的影响,故此模型可以更加有效的反映潜在的临床情况,对临床研究更有价值[13]。内皮细胞以TLR 4依赖的方式对LPS作出反应,导致促炎因子的释放和粘附分子表达的增强[14]。据研究表明,LPS可以影响急性肺损伤的多个过程,引起多种促炎因子释放,如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等[15],其中,TNF-α和IL-1β可以诱导内皮细胞的细胞骨架重塑,增加肺血管通透性[16]。本研究中ELISA实验结果显示,脂多糖“二次打击”可以明显引起肺部炎症反应,川芎嗪对急性肺损伤有治疗效果,其中中浓度(100 mg/kg)川芎嗪可以明显降低脂多糖引起的肺部炎症因子升高和炎性细胞浸润,此结果与肺组织病理切片结果相一致。而高浓度(150 mg/kg)川芎嗪治疗效果较差,这可能与过高浓度的药物腹腔注射对小鼠肝肾功能损害有关,机体代谢受到影响从而影响川芎嗪对肺部炎症治疗效果。由此结果我们确定了后续实验的川芎嗪最佳给药浓度。目前临床上对于急性肺损伤的治疗还没有确切的治疗方案,主要以原发病治疗和呼吸支持治疗为主要手段[17]。

哺乳动物雷帕霉素抑制靶点(mTOR)是下游的丝苏氨酸激酶,存在于两种复合体(mTORC1、mTORC2)中[18],这两种复合体在功能和底物特异性上不同,mTORC1调节细胞生长和增殖,mTORC2通过RhoA/Rac1调节肌动蛋白细胞骨架和细胞运动[19]。有研究表明,抑制mTORC1(Raptor)和mTORC2 (Rictor)通过减少肌动蛋白细胞骨架的重塑和减少小GTP酶RhoA和Rac1的激活来抑制细胞的迁移和结直肠癌的进展[7]。另一项研究表明雷帕霉素可以通过mTORC1介导的S6K1和4E-BP1信号通路下调RhoA活性来抑制细胞骨架重组和细胞迁移[20],此外mTOR和RhoA的激活是1-磷酸神经酰胺刺激巨噬细胞增殖的重要机制的[21]。由于内皮紧密连接的屏障作用,毛细血管对血浆蛋白的通透性通常很低,炎性介质通过刺激内皮细胞收缩和内皮间隙的形成来增加内皮通透性,由此导致细胞旁通透性增加使富含蛋白质的水肿渗入间质,这是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)等多种病理状况的潜在原因[22]。RhoA GTP酶作为分子开关可以对细胞外信号做出响应,诱导肌动蛋白细胞骨架的组织和基因转录的协同变化,以驱动多种生物反应,包括形态发生、趋化性、轴突导向和细胞周期进程[8]。Rho GTP 酶通过其对肌动蛋白细胞骨架组织和内皮间连接完整性的作用参与调节内皮细胞通透性,在细胞培养研究中,RhoA 的激活会导致肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的抑制,随后是肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化的增加和肌动蛋白应力纤维的形成引起内皮间连接破坏并增加内皮通透性[23],从而引起血管渗漏。对于细胞骨架的研究涉及的比较多的是 Rac1/PAK/LIMK1/Cofilin以及RhoA/ROCK/LIMK1/cofilin两大信号通路,mTOR作为两大信号通路的上游蛋白,可能对细胞骨架重排引起的肺血管渗漏起着重要作用。EB(Evans Blue)是一种深蓝色的染料,入血后迅速地与白蛋白结合,在内皮屏障损伤的情况下白蛋白会透过内皮屏障,所以我们用能与白蛋白结合的 EB 作为示踪物质来观察内皮屏障的通透性变化情况。本研究中脂多糖造模后EB染料的渗出明显高于对照组,用川芎嗪治疗后,EB染料的渗出有所缓解,表明川芎嗪对急性肺损伤肺血管通透性有治疗作用。本研究通过Western Blot实验技术检测各处理组肺组织中的P-mTOR和RhoA蛋白表达量,结果发现脂多糖处理后mTOR/GAPDH与RhoA/GAPDH明显升高,川芎嗪治疗后下降,这与之前的研究报道相一致[20]。

川芎嗪是中药川芎的主要有效成分,其化学式为C8H12N2,又名四甲基吡嗪(TMP)。川芎嗪能提高免疫功能,具有抗炎、抗血小板聚集、抗凋亡作用,常用于心血管系统疾病和呼吸系统疾病的治疗[24]。在肺相关研究中,TMP 可有效降低 LPS 诱导的小鼠肺损伤,包括降低肺湿干比以及促炎因子和 TLR4 的表达[25]。在本研究中我们证实 TMP 可以显著改善脂多糖诱导的 ALI 小鼠炎症反应,减轻肺部炎症细胞的浸润,降低 BALF 中的蛋白质浓度、总细胞数、中性粒细胞数。此外,TMP 可以在体内和体外抑制巨噬细胞的焦亡和凋亡[26]。这些结果为TMP治疗ALI的可行性提供了可靠依据。前期我们在细胞实验内已经证实川芎嗪可以减少脂多糖引起的脐静脉内皮细胞mTOR表达及细胞骨架应力纤维增多并可逆转脂多糖导致的内皮细胞单层细胞通透性增加和TEER降低[27]。血管内皮细胞屏障功能失调和由此造成的肺血管通透性增加是急性肺损伤的基本特征,川芎嗪可以改善内皮细胞功能障碍对急性肺损伤的治疗至关重要,综上,TMP可以减少促炎因子的释放,并可通过抑制mTOR/RhoA信号通路,减少应力纤维形成从而抑制细胞骨架重排,对血管内皮屏障起到保护作用。

综上,川芎嗪对脂多糖诱导的急性肺损伤有治疗作用,并且可以抑制mTOR/RhoA信号通路对脂多糖引起的肺血管通透性增加有治疗作用。川芎嗪可以通过影响细胞骨架改善肺血管通透性,从而缓解肺损伤引起的炎性因子及蛋白的渗漏作用。