中性粒细胞外诱捕网在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展

崔旭东 道日娜 杨敬平 徐喜媛 孙丽

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种异质性肺部状态,以慢性呼吸道症状为特征,气道异常和/或肺泡异常导致的持续性气流阻塞[1],是世界范围内发病率和死亡率均高的慢性疾病。全球≥40岁人群中COPD患病率达到9%～10%,死因处于第3位[2]。2019年我国死因监测数据显示[3],在我国居民十大死因中,COPD占全因死亡的10.6%,居第4位。故寻求一种COPD新的诊断工具和治疗策略就变得极具意义。近年研究发现将近80%的COPD患者痰液中含有NETs,而且急性加重期的COPD患者痰液中NETs的丰度要明显高于轻度患者[4]。NETs可通过其组分的细胞毒性及促炎作用参与其相关的慢性肺部疾病的发生发展。最新研究发现[5],NETs能够激活METTL3介导的m6A修饰以诱导肺泡上皮细胞铁死亡,调节脓毒血症相关性急性肺损伤。本综述针对NETs在COPD发生发展及治疗等方面进行阐述。

一、NETs的产生与功能

NETs最早由布林克曼等发现,当中性粒细胞受到脂多糖(LPS)或IL-8的刺激后,会产生一种由直径15～17 nm的纤维网和直径25 nm左右的球状结构域组成的胞外网状结构。该结构主要以胞外DNA为骨架,多种活性蛋白镶嵌其中,包括中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、组织蛋白酶G(Cath G)和髓过氧化物酶(MPO)[6]。NETs通过一种称为“NETosis”的独特的细胞死亡形式响应特定的刺激后而形成,它在先天性免疫中发挥着独特的作用,与凋亡、坏死等方式完全不同,是一种活跃的细胞死亡形式,主要途径为NADPH氧化酶( Nox2 )依赖性和Nox2非依赖性,二者在机体防御中协同发挥作用。其中与COPD密切相关的是NADPH氧化酶( Nox2 )依赖途径。在感染的刺激下,LPS等物质可通过与细胞膜TLR4受体结合,激活PKC-Raf-MEK-ERK通路,激活Nox2,刺激活性氧(ROS)的产生,从而活化大量存在于胞浆中的肽酰基精氨酸脱亚胺酶 4 (PAD4)进而促进胞浆噬天青颗粒释放MPO、NE转位至细胞核切除组蛋白N端尾部,减弱结合能力,协助染色质的解聚过程。此外,活化PAD4可通过诱导组蛋白的精氨酸侧链过度瓜氨酸化,表面正电荷的消失,减弱结合能力,染色质解聚。最终核膜及细胞膜在ROS、MPO及NE等物质的作用下破裂,NETs释放。NETs具有抵抗感染、限制细菌远处传播的作用,是抵抗入侵微生物的有效机制。但其在杀菌防御和宿主组织损伤之间的平衡作用并不明确。研究表明[5],NETs诱导肺泡上皮细胞铁死亡,调节脓毒血症相关性急性肺损伤,还参与慢性肺部疾病的发生发展,如肺囊性纤维化[7]、哮喘[8]和细菌性肺炎[9]。

二、NETs在COPD发病中的作用

COPD的病因主要是吸烟和吸入来自家庭、室外空气污染的有毒颗粒和气体,但其他环境和宿主因素也可能起作用[10]。慢性气道炎症、气道黏液高分泌所致持续气流受限及肺气肿形成是 COPD 的主要病理生理改变;肺动脉高压所致慢性肺源性心脏病是COPD的常见并发症;细菌感染是AECOPD的主要原因。NETs参与上述COPD发生、发展过程。

1 NETs在COPD 病因中的作用

研究发现,烟草作为COPD最常见的病因,其提取物 CSE可通过Nox2依赖的方式诱导NETs形成[11]。其他相关环境因素如交通相关污染(TRAP)、有毒重金属镉( Cd )的暴露同样被证明可以刺激NETs的形成[12-13]。Wooding等研究了从不吸烟者、曾经吸烟健康者和轻中度COPD患者,暴露于柴油车尾气和过滤空气,发现可明显增加柴油车尾气受试者NETs的数量。Cd通过激活ERK、MEK信号通路和Nox2诱导NETs形成[12]。此外,NETs通过自身正反馈调节及清除减少,导致在COPD患者肺部过度累积,参与COPD发病。研究表明:NETs 本身可通过组蛋白,在Th17细胞促进因子的存在下,直接作用于T细胞TLR2,诱导STAT3的磷酸化,促进Th17细胞的分化,导致 IL-17的产生增加,驱动前馈回路,参与了NETs在COPD患者肺部的过度累积[14]。在生理条件下,肺部组织的NETs一般可以通过内源性核酸酶、巨噬细胞进行清除来维持平衡避免其损伤效应。Kylie等研究人员认为,COPD患者中肺泡巨噬细胞数量稀少,吞噬作用缺陷[15],导致NETs清除减少。研究表明:Cath G能通过分解肺表面活性剂蛋白D(SP-D),抑制SP-D与NETs 的结合,减弱两者之间的相互作用,进一步抑制肺泡巨噬细胞对NETs的清除作用[16]。

2 NETs在COPD 慢性气道炎症中的作用

NETs作为内源性损伤相关分子模式,不仅可诱导单核细胞和巨噬细胞产生IL-1b、IL-1a和IL-6诱导炎症,还可通过TLR4、NF-κB信号通路在炎症和粘液高分泌中发挥关键的调节作用[17]。研究发现[18],过量 Cath G 活化促使 IL-8、TNF-α和IFN-γ等促炎细胞因子的积累聚集,造成ROS大量增加,诱导杯状细胞脱颗粒,损伤肺组织。NE作为NETs相关宿主免疫防御中的关键一环,可直接消化抗炎分子颗粒蛋白前体(PGRN)并通过其产物GRN肽( GRN-B )诱导IL-8的表达[19]。如此形成炎症的恶性循环,引起呼吸爆发,ROS大量积累,进而导致气道上皮损伤及肺泡血管内皮功能障碍,机体的免疫失衡,导致COPD的发生发展。

3 NETs在COPD 气道粘液高分泌及肺气肿形成中的作用

气道黏液高分泌是 COPD 发生发展中的重要因素,哥本哈根心脏研究中心通过为期10年的访视发现,慢性黏液高分泌人群肺部感染风险增加、死亡率增高[20]。NETs可通过结合气道上皮细胞受体诱导或刺激巨噬细胞释放IL-1β,促进 MUC5AC基因高表达[21],导致气道高分泌。NE和Cath G作为气道杯状细胞的促分泌剂[22]可与作为痰液成分的胞外DNA进一步增加粘液粘稠度,气道阻塞,持续性气流受限。Cath G可分解肺表面活性物质蛋白SP-D,促进小鼠肺组织中ROS水平升高,激活基质金属蛋白酶(MMP)的产生,降解肺泡壁胶原纤维、弹性纤维等成分,引起肺泡壁塌陷或形成大疱从而导致肺气肿[23-24]。组蛋白可以通过干扰Ca21稳态和线粒体毒性机制,对气道上皮等肺细胞结构产生直接的细胞毒性作用,进而参与COPD的发生发展[25]。

4 NETs在COPD导致的肺动脉高压中的作用

肺动脉高压作为COPD的常见并发症,主要由低氧血症引起,可导致患者脏器受损,增加再入院风险,是 AECOPD 患者预后不良及死亡的重要原因。肺动脉高压的病因复杂,包括内皮功能障碍、原位血栓的形成及内皮细胞和平滑肌细胞的重塑和增殖。NETs不仅可以为红细胞的黏附和血小板的距离提供支架,还能增强血管内皮生长因子(VEGF)和MMP-9的分泌并协同VEGF刺激内皮细胞增殖[26],还可以通过TLR2介导的组蛋白对血小板的活化作用,驱动血浆凝血酶的产生[27],进而参与血栓的形成及肺部血管重塑,促使生理性无效腔的增大,通气与血流比例失调,肺泡及毛细血管的大量丧失,弥散面积减少,导致换气功能障碍,进一步加重病情。

5 NETs在COPD患者细菌定植及耐药性中的作用

细菌感染是 AECOPD的主要原因,30%～70%的 AECOPD与细菌感染密切相关[28]。此外,肺部感染还是COPD患者最严重的并发症,是患者病死的主要因素。J.Eklöf等通过对2010年1月1日至2017年10月31日就诊的22053例COPD门诊患者随访,发现合并铜绿假单胞菌感染的AECOPD患者死亡的风险将会显著增加[29]。而胞外DNA作为NETs的抗菌成分[30],当细菌入侵或慢性定植于气道时,胞外DNA可通过螯合和去除细菌外膜中的二价阳离子,造成膜扰动和细胞裂解进而发挥抗菌活性。但研究表明COPD患者痰中分离出铜绿假单胞菌具有极高的突变率和抗生素耐药性[31]。亚抑菌浓度下的胞外DNA能够诱导细菌耐药性的形成[32]。亚抑菌浓度DNA可通过创造阳离子限制环境,诱导铜绿假单胞菌中Pho PQ和Pmr AB调控的阳离子抗菌肽耐药操纵子PA3552-PA3559表达上调,最终可能导致细菌的长期定植及耐药性的形成,参与COPD的发生发展。

三、NETs在COPD治疗中的作用

因此以NETs的形成及相关组成成分作为靶点的研究,对探索COPD疾病的治疗和特异性靶向药物的开发具有极其重要的意义。

1 Nox2/PAD4抑制剂

PAD4作为NETs产生与释放的过程中不可或缺的角色,BB-Cl-脒作为PAD4特异性抑制剂可阻断吸烟诱导的NETs的产生。研究表明,PAD4抑制剂已被证明可以明显减轻NETs相关炎性效应,减少炎症细胞浸润,改善内皮依赖性血管舒张,保护脏器,延缓病情进展[5]。大环内酯类抗生素还具有调节NETs释放的作用。国外学者发现,在小鼠模型中,红霉素可通过对Nox2抑制的作用,减少气道NETs,进而减轻NETs相关 Th17的产生与分化,减轻实验性肺气肿小鼠模型的肺部炎症[33]。后续的体外实验更是进一步证明,红霉素在体外对CSE诱导的NETs相关NE及MPO也表现了较好的抑制作用。其他抗生素如头孢噻肟,就对这个过程没有影响。此外,罗红霉素还可显著减弱MUC5AC表达和NF-κB核易位,以缓解NETs诱导的肺部炎症反应及气道粘液分泌过多[34]。还有学者认为茶提取物(CLE)给药也可以作为一种预防或治疗CSE诱导的COPD新的治疗策略。CLE可以抑制PMA诱导的HL-60细胞内ROS,进而抑制NETs的产生[35]。因此,Nox2/PAD4抑制剂在避免NETs在COPD患者中过度累积中具有一定的治疗前景。但其具体的临床应用效用仍待进一步的探索,这可能会是未来靶向治疗的新方向。

2 脱氧核糖核酸酶

DNase作为一种核酸内切酶,不仅可以催化NETs中胞外DNA的降解,以避免NETs相关细菌耐药的形成、改善气道粘液粘稠度,还可以降低了NETs相关MUC5AC高表达、减少了诱导的杯状细胞化生并通过降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平改善气道内炎性细胞的浸润。在小鼠模型中[36],这些都已得到了有效的验证,雾化吸入DNase减轻的小鼠气道炎症和黏液分泌过多的有效性,而且学者们还将其与TLR4/NF-κB信号通路联系了起来,这可能是COPD未来治疗的新方向。虽然DNase的治疗效用在相关小鼠模型得到了一定验证。但是后续研究发现,铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌刺激下释放的NETs,在使用DNase治疗后,会造成肺组织损伤,进一步加重病情[37]。这可能与NETs降解造成的蛋白酶释放和活性增加有关。

3 蛋白酶抑制剂

蛋白酶抑制剂可直接抑制NE、Cath G等蛋白酶活性,减少其在炎症部位附近的组织潜在的扩散和诱导损伤。西维来司钠作为小分子NE抑制剂,可选择性抑制弹性蛋白酶,抑制IL-8等炎性因子释放及气道黏液高分泌。Wang K.[38]等的研究发现,抑制NE可阻断中性粒细胞中的NE核易位和染色质解聚来预防CSE诱导NETs形成,进而消除CSE诱导NETs相关ROS产生和中性粒细胞的迁移损伤,减轻COPD患者的气道炎症,同时干扰NETs与杯状细胞相互作用,抑制粘液分泌杯状细胞增生和肺气肿样肺泡破坏的改变等关键病理变化,改善肺功能。

4 组蛋白抑制剂

高水平的循环组蛋白与许多疾病严重程度呈正相关。组蛋白作为NETs前馈回路的组成部分,不仅能够诱导机体免疫失衡,还对肺部组织细胞具有直接的细胞毒性。而非抗凝肝素已被证明在体外结合组蛋白并中和其细胞毒性,明显降低相关炎症性疾病模型死亡率[39]。此外,研究发现,抗凝血肝素还可以从NETs的染色质纤维中去除组蛋白,破坏NETs的完整性,以实现抗血栓的效果。可见组蛋白抑制剂在COPD中有潜在的治疗作用,但需要进一步研究。

越来越多的证据都表明,气道及肺组织中过度累积的 NETs参与COPD的发生发展进程。因此针对NETs的靶向治疗,可能是未来COPD治疗重要研究方向。虽然NETs 在COPD中的具体作用机制及相关信号通路的研究目前仍处于起步阶段,但随着 NETs相关分子机制的不断深入研究,其有望成为COPD治疗策略新靶点。