通过血液靶向NGS检测布氏杆菌感染1例分析

李 祥 张文莹 张小河

广东省揭西县人民医院 515400

布氏杆菌病是人兽共患病,其主要从感染的动物宿主传染给人。布氏杆菌是小型革兰阴性需氧菌,属于兼性胞内寄生菌。马耳他布鲁菌可通过气雾播散,在流行区,动物通过吸入病原菌感染是主要的感染途径[1]。为病畜接生、剥牛羊皮、剪毛、切肉改刀等均可受染,经口摄入感染的生乳、乳制品或病畜肉类未煮熟都会造成感染迹象[2]。布氏杆菌病通常潜伏期1～3周,也可更长。临床表现多样,可出现高热、多汗、乏力、关节痛等症,部分可伴有肝脾、淋巴结肿大等,常缺乏特异性症状。由于布氏杆菌是胞内菌,因而相对抗生素而言不易接触到病原菌,很难根治且易复发,故治疗上强调抗生素联合应用、长疗程治疗[3]。 由于布氏杆菌感染的不确定性,许多患者施行了不必要的诊断性治疗,消耗了医疗资源,也给患者带来了痛苦,甚至终身的手术并发症[4]。因此,如何提高患者的诊断准确率至关重要,近年来人们在基因测序检测方面取得了突破,提高了布氏杆菌感染的诊断率。本文现通过血液靶向二代基因测序(Next generation sequencing technology,NGS)检测1例布氏杆菌感染,总结病例特点及检测优势,帮助临床医生在遇到类似病例时有效选择相应的检测方法,避免时间和资源浪费,报道如下。

1 病例资料

患者女,31岁,因“反复发热3d”于2022年8月25日收入我院内一科。患者诉3d前无明显诱因出现反复发热,最高温度为39.5°C,无畏寒,无头晕、头痛,无咳嗽、咳痰,无胸闷、气促、心悸,无午后潮热、盗汗,无关节疼痛、皮疹,无腹痛、腹泻、腹胀,无尿急、尿痛、尿频,无四肢乏力、肿胀等,自行口服退热药治疗(具体药物不详),症状反复,自起病以来,睡眠、食欲、精神一般,大小便正常,体力、体重无明显变化。既往史、月经史、婚育史及家族史无特殊。个人史:在本地经营一家羊肉店,平素以贩卖羊肉为主业,余无特殊。入院体检:T:38.4℃,P:104次/min,R:20次/min,BP:110/73mmHg(1mmHg=0.133kPa)。神志清,查体合作,对答切题,全身皮肤黏膜无黄染,未见蜘蛛痣及肝掌。全身浅表淋巴结未扪及肿大。心肺查体未见异常,肝脾未触及肿大,余查体未见异常。入院后查:血常规五分类套餐+全程C反应蛋白:白细胞 5.90×109/L、血小板 156×109/L、中性粒细胞绝对值 2.01×109/L、嗜酸性粒细胞绝对值 0.00×109/L、中性粒细胞百分比 34.00%、淋巴细胞百分比 59.50%、C-反应蛋白 <6.00mg/L、超敏C-反应蛋白 3.51mg/L。N末端-B型钠尿肽前体 1 383.80 pg/ml,降钙素原 0.12ng/ml。 贫血三项:维生素B12629.90pmol/L,甲功五项:促甲状腺激素 7.930μIU/ml。尿常规、大便常规、PCT、血沉、抗核抗体17项、狼疮二项及狼疮抗凝物质等未见异常。2022年8月25日 螺旋CT胸部:双肺上叶多发结节灶,考虑炎性肉芽肿,建议随诊复查。入院后8月25日开始予“头孢唑肟 2g q12h 静滴+多西环素 0.1g bid 口服”抗感染治疗及相关支持治疗,8月25日、8月26日、8月27日三日均有持续中—低热,其中8月27日 18:30 Tmax39.2℃。2022年8月27日靶向病原精简版90种病原体(DNA+RNA+耐药基因):(1)细菌:未检出;(2)真菌:烟曲霉(820);(3)DNA病毒:未检出;(4)RNA病毒:未检出;(5)菌属:布鲁菌属(214);(6)其他病原体:未检出;(7)耐药或毒力基因:未检出。结合患者病史、病情及血NSG结果考虑患者为布氏杆菌感染,于8月27日夜间加用“注射液硫酸链霉素1g:肌注 qd”,8月28日开始,患者未再次出现发热。8月28日暂停头孢唑肟,后续以多西环素+链霉素联合治疗。8月29日B超检查:子宫+肝胆胰脾+双肾膀胱+心胞:肝右叶内强回声斑,考虑:肝内胆管结石?钙化灶?请结合临床。脾大;脾门处异常实质性声像,考虑副脾。心包积液(少量)。胆胰、泌尿系、子宫、双侧附件区未见明显异常声像。8月31日布鲁菌抗体三项结果回报:布鲁菌IgG抗体(+),布鲁菌病试管凝集试验1∶400,布鲁菌病虎红平板凝集试验(+)。继续维持前治疗,9月12日暂停链霉素(共使用15d),至9月13日患者出院未再出现发热。入院经过积极诊治,病情已得到控制,体温恢复正常,出院后患者继续口服“多西环素 0.1g bid”,定期至我院随诊,无诉发热。

2 方法

NGS 检测:(1)仪器试剂:北京天根生化科技有限公司产品生产的血液基因组 DNA 提取试剂盒;迈基诺基因科技公司完成NGS。(2)检测:采集患者外周血标本5ml,EDTA 抗凝,应用DNA 提取试剂盒提取患者体内3～5μg DNA 。设计布鲁菌病相关基因列表,该基因组合(panel)未申请专利或参加临床试验。BDHAP-2014包含217个布鲁菌病致病基因的全部外显子及剪接位点目标序列捕获探针。收集提取到的 DNA,用超声波打断并制备DNA文库,通过捕获芯片富集217个布鲁菌病致病基因的外显子及其临近的内含子区域的DNA,行 PCR 扩增,最后应用 IlluminaHiseq 测序平台对扩增产物进行 NGS,以检测上述目标基因是否存在潜在突变。靶向区域平均基因覆盖度98.46%,平均测序深度为436.75×,90.14%的靶向区域覆盖度>30×,60.29%的靶向区域覆盖度>200×。将测序结果与dbSNP 数据库、HGMD 数据库及千人基因组数据库进行比对。

3 讨论

布鲁菌病(Brucellosis)又称波浪热,由布氏杆菌感染引起,以长期发热、关节疼痛、肝脾大和慢性化为特征的传染病,属国家法乙类传染病。布氏杆菌属球状G-菌,可分为羊、牛、猪、犬、绵羊附睾及沙林鼠种菌。其中羊种菌致病力最强,猪种菌次之,布氏杆菌传染源为病畜,通过皮肤黏膜接触、消化道及呼吸道等多种途径进行传播[5]。我国主要以内蒙古、黑龙江、新疆、西藏等以畜牧业发达的地区发病多见,年新发患者为25 000～30 000人[6]。布鲁菌病急性期与慢性期症状各异,前者可表现为发热、多汗、关节疼痛、神经痛和肝脾/淋巴结肿大等;后者多表现为神经、精神症状,并伴有骨、关节系统损害。

由于目前布氏杆菌感染的情况相对少见,关于此菌感染的诊断有时比较困难,尤其是病原菌的培养阳性率低,可能对治疗造成一定的干扰和延误。目前协助诊断的主要为结合临床表现、初筛试验,其中临床表现和初筛试验主要用于发现疑似病例,而实验室检查多依赖于布氏杆菌血清凝集试验滴度升高、血液和组织培养阳性、血清中布氏杆菌抗体阳性,其中血清学试验是基础性检验,而细菌培养是布氏杆菌感染的金标准,但细菌培养存在一定假阴性,且耗时较长,不利于疾病治疗[7]。本院近日接收1例无故反复发热患者,入院后完善了一系列感染、肿瘤及风湿免疫相关检查,尿常规、大便常规、PCT、血沉、抗核抗体17项、狼疮二项及狼疮抗凝物质等未见异常,自身免疫及肿瘤相关化验均无明显阳性提示,仅胸部CT提示双肺上叶炎性肉芽肿,那么,患者持续3d的高热,真是由于轻微的肺炎所致?所幸患者入院应用抗生素治疗前,先一步留取了外周静脉血送检行靶向病原精简版90种病原体(DNA+RNA+耐药基因),后经我院微生物室回报,NGS检测出菌属:布鲁菌属(214) 。至此,元凶终于揭开神秘面纱——布氏杆菌病。笔者采用血液靶向NGS辅助早期诊断布氏杆菌感染,提高了布氏杆菌的检出率,达到早诊断、早治疗、早痊愈的临床目的。靶向病原微生物检测,覆盖临床常见的90种病原体和90个耐药基因,其具有精确、灵敏度高、简单易行、经济实惠等优势,可自行设定兴趣基因谱的广度以及覆盖深度,用于临床诊断不明感染查因具备很大优势,可为临床使用抗菌药物做参考[8]。而本例患者在本地经营一家羊肉店,平素以贩卖羊肉为主业,并亲自对生羊肉进行清洗加工,由此感染,这也提示临床对于不明原因的高热感染需详细了解患者的个人史,有无牛羊牲畜接触史等,结合临床表现判定。

总之,靶向NGS具有检测速度快、起始样本量低、检测病原微生物种类多、不受血制品输注的影响,不受病毒感染、再障危象等并发症的影响等特点。因布氏杆菌感染相对少见,临床缺乏特异性表现,易发生误诊漏诊,靶向NGS技术为布氏杆菌感染的诊断提供了一种新的思路,可以取患者血液进行检测,提高诊出效率,尽快使用敏感抗生素,减轻患者的痛苦,起到早诊断、早治疗、早治愈以及早康复的作用。将来随着靶向NGS的panel不断优化以及更多致病基因的详细研究,靶向NGS在疑诊罕见菌群感染的诊断中会越来越广泛应用。