绝经综合征患者肠道菌群结构变化及桂仙合剂的干预作用*

毛婷，刘雅倩，宗云，周英

1 广州中医药大学第一临床医学院 广东广州 510405

2 东莞市妇幼保健院 广东东莞 523057

3 广州中医药大学第一附属医院 广东广州 510405

绝经综合征（menopausal syndrome，MPS）指妇女绝经前后出现性激素波动或减少所致的一系列躯体及精神心理症状[1]。早期表现以月经紊乱、血管舒缩症状及自主神经功能失调为主，如潮热、出汗、烦躁、失眠等症状；远期可并发心血管病变、骨质疏松、阿尔茨海默病、泌尿生殖道症状等[2]。根据世界卫生组织数据，到2030年全球将有超过12亿绝经妇女，中国将超过2.1亿，其中将有69.5%～80%的妇女被MPS困扰[3-4]。课题组前期临床研究表明桂仙合剂（Gui Xian Decoction，GXD）治疗MPS有良好疗效[5]，但作用机制尚不明确。近年来，基于16S rRNA测序技术探究肠道菌群与疾病的相关性、肠道菌群与药物作用机制的相关研究已成为焦点，但目前国内外研究MPS与肠道菌群的相关研究较少，研究的深入性亟待提高，而中药在调节肠道菌群方面优势巨大[6-8]，GXD是否可以通过调节肠道菌群结构治疗MPS有待被揭晓。本研究基于16S rRNA测序技术探究MPS患者肠道菌群结构特点及中药复方GXD干预后肠道菌群的变化，分析GXD治疗MPS的作用机制，为临床治疗MPS提供新思路。

资料与方法

1 入组标准

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断 参照《妇产科学》（第9版）[1]的有关内容拟定：①40～60岁女性；②月经紊乱或停闭；③有植物神经改变（潮热、盗汗、失眠、烦躁等症状，有其中一个或多个症状）；④促卵泡生成素（FSH）水平升高，雌二醇（E2）水平降低。

1.1.2 中医诊断 参照马宝璋主编《中医妇科学》[9]拟定肾阴阳虚证候：潮热汗出，腰膝酸软，头晕耳鸣，五心烦热，舌苔薄，脉沉弱或细。

1.2 纳入标准 E组必须符合以下标准：①符合中西医诊断标准；②国内改良的Kupperman Index（KI）评分≥15分；③签署知情同意书者。H组必须符合以下标准：①40-60岁女性；②改良KI评分＜15分；③签署知情同意书者。

1.3 排除标准 ①诊断考虑子宫平滑肌瘤（有一条径线＞3cm），或子宫内膜异位症，或双侧卵巢切除，或重度乳腺增生，或生殖系统恶性肿瘤者；②原因不明的阴道不规则流血未治愈者；③合并有心脑血管、肝、肾、内分泌和造血系统等严重原发性疾病或精神病者；④近3个月内使用过性激素药物者；⑤存在影响口服药物吸收的状况者（例如胃切除术）；⑥过敏体质患者；⑦近2周内使用过抗生素者。只要符合以上其中一项即排除。

2 一般资料

选取2020年6月—2021年8月就诊于广州中医药大学第一附属医院的MPS患者35名作为MPS组（E组，n=35），同时招募12名绝经前后健康女性作为健康组（H组，n=12），E组患者在GXD干预后作为治疗组（AE组，n=35）。MPS组与H组在身体质量指数（t=0.49，P=0.63）、高血压患病人数（χ2=0.72，P=0.40）、糖尿病患病人数（χ2=0.35，P=0.55）上均无差异，两组具有可比性。本研究经广州中医药大学第一附属医院伦理委员会（批件号：NO.ZYYECK【2020】021）批准，获得患者知情同意并签署知情同意书。

3 治疗方法

AE组采用GXD治疗，组方：仙茅5g，仙灵脾5g，巴戟天15g，当归10g，知母5g，黄柏5g，生龙骨30g，生牡蛎30g，龟板20g，桂枝10g，白芍10g，炙甘草10g，大枣10g，生姜10g，连续服用21d为1疗程，停药7d（治疗中断期），共治疗3个疗程。

4 粪便标本收集及处理

4.1 粪便标本采集 H组标本于招募后第2天采集，E组标本在中药干预前1周内采集，AE组标本在中药干预后1周内采集。标本均在非经期清晨空腹状态下，用竹签挑取2~3g粪便放置在无菌便盒中，做好相对应标记后，于-80 ℃冰箱保存。

4.2 粪便细菌DNA提取及测序分析 以DNA提取试剂盒提取粪便标本细菌基因组DNA后，采用lllumina MiSeq/Novaseq测序平台进行双端测序。采用Qiime2软件中的DADA2插件对所有标本的全部原始序列进行质量控制、去噪、拼接及去嵌合体，使数据达到分析要求后获得扩增特征序列（Amplicon Sequence Variant，ASV）。将序列比对到 SILVA数据库（13.8版本），得到物种的分类信息表，并根据分类数据进行多样性分析、差异分析及功能预测。

5 统计学方法

采用SPSS23.0软件进行统计学分析，计量资料符合正态分布时，两组间比较采用t检验，3组间比较采用one-way ANOVA；计量资料不符合正态分布时，两组间比较采用Wilcox秩和检验，3组间比较采用Kruskal-Wallis检验，并采用Dunnett法进行多重比较。计数资料以频数或百分率（%）表示，两组间比较采用χ2检验。采用ANOSIM分析比较组间和组内差异的大小。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 3组患者肠道菌群扩增特征序列分析

将3组共82份粪便样本在属水平上以100%相似度进行聚类，共获得注释扩增特征代表序列（Amplicon Sequence Variant，ASV）25033个。绘制可直观表现3组ASV数目组成特异性及相似性的Venn图（图1A），结果显示：E组、AE组、H组的ASV数目分别为8537、13564、3080，其中，每组特异的ASV数目分别为8424、13462、3028，3组共有的ASV数目仅有29个。

图1 H组、E组和AE组肠道菌群Venn图及多样性分析

2 3组肠道菌群多样性分析

2.1 Alpha多样性 以Chao1指数（图1B）衡量肠道菌群物种丰富度，以Simpson指数（图1C）衡量菌群多样性，Shannon指数（图1D）在评估菌群多样性时综合考虑了群落的丰富度和均匀度，能更加真实地展示3组肠道菌群多样性[10]。结果 显示：E组与AE组间Chao1指数、Simpson指数及Shannon指数均有显著差异（Wilcoxon Test，P＜0.05），而E组与H组、AE组与H组间3个指数均无显著差异（Wilcoxon Test，P＞0.05）。

2.2 Beta多样性 以Weighted Unifrac距离计算方式进行主坐标分析 （principal coordinates analysis，PCoA，图1E）及非度量多维尺度分析 （non-metric multidimensional scaling，NMDS，图1F），评估不同分组间肠道菌群结构的多样性。PCoA结果显示：E组与AE组有显著差异（ANOSIM，P=0.014），但AE组与H组之间无显著性差异（ANOSIM，P＞0.05）。NMDS结果显示：stress值为0.1237，表明图形有一定的解释意义，AE组相较于E组肠道菌群的多样性发生显著性变化，且与H组无显著性差异。

3 3组患者肠道菌群物种组成

将3组肠道菌群ASV的物种注释及丰度信息与SILVA数据库（13.8版本）进行比对获得物种注释信息，以堆叠柱状图表示（其中未分类者归为“Unclassified”，图中仅展示出相对丰度排名前20的菌，其余归为“Other”）。

在门水平上，3组样本共鉴定出58个菌门，名称在Taxanomy_phylum下列出（图2A）。3组肠道菌群丰度最高的前3个优势菌门相同，且表达丰度所占百分比均为厚壁菌门（Firmicutes）＞拟杆菌门（Bacteroidetes）＞变形菌门（Proteobacteria），但3个优势菌门在不同分组的表达丰度所占百分比存在差异。相较于H组，E组厚壁菌门（Firmicutes）/拟杆菌门（Bacteroidetes）值（F/B）降低，但无显著性差异（ANOVA，P＞0.05）；在GXD干预后比值上升，AE组与E组间有显著性差异（ANOVA，P=0.023），而与H组无差异（ANOVA，P＞0.05）。

图2 肠道菌群物种结构分析

在属水平上，3组样本共鉴定出687个菌属，菌属名称在Taxanomy_genus下列出（图2B）。3组丰度最高的前两个菌属均为拟杆菌属（Bacteroides）及粪杆菌属（Faecalibacterium），其余注释得到的菌属在不同组中表达丰度不完全一致。其中经粘液真杆菌属（Blautia）、另枝菌属（Alistipes）在AE组中显著富集（Kruskal-Wallis，P＜0.05），而在H组及E组中表达丰度相对较低。

4 3组患者差异菌群分析

为确定3组间重要的肠道差异菌群，利用线性判别分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）进行比较（图3A，图中仅展示出相对丰度排名前20的菌）。相较于E组和AE组，H组有36个肠道菌群丰度明显升高（LDA score＞2，P＜0.05），其中直肠真杆菌属（Agathobacter）对菌群间显著性差异影响力最大（LDA score=4.42）；相较于H组及AE组，E组有6个肠道菌群丰度明显升高（LDA score＞2，P＜0.05）；相较于H组及E组，AE组有76个肠道菌群丰度明显升高（LDA score＞2，P＜0.05），其中经粘液真杆菌属（Blautia）对菌群间显著性差异影响力最大（LDA score=4.04）。

图3 差异菌群分析

基于负二项分布的DESeq2软件，以P＜0.05且|log2FC|≥2为条件分别筛选E组与H组、AE组与E组之间的差异肠道菌群（图3B、图3C），并观察相关差异菌群在GXD干预后相较于E组及H组平均丰度的改变（表1）。结果 显示：E组有6个肠道菌群丰度显著高于H组，分别是黄杆菌属（Flavonifractor）、霍尔德曼氏菌属（Holdemanella）、Odoribacter菌属、CAG_352菌属、丁酸弧菌属（Butyricimonas）和弧菌属（Vibrio），在GXD干预后黄杆菌属（Flavonifractor）、霍尔德曼氏菌属（Holdemanella）丰度上调；有2个肠道菌群丰度显著低于H组，分别是直肠真杆菌属（Agathobacter）、梭菌属（Clostridia_UCG_014），且均在GXD干预后丰度上调。与E组相比，AE组有9个肠道菌群丰度显著下调，分别是毛螺菌属（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、巨球型菌属（Megasphaera）、嗜胆菌属（Bilophila）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、颤螺菌属（Oscillibacter）、韦荣氏球菌属（Veillonella）、阿克曼菌属（Akkermansia）、瘤胃球菌属（Ruminococcus_gnavus_group），其中嗜胆菌属（Bilophila）及韦荣氏球菌属（Veillonella）丰度达到H组水平，而克雷伯氏菌属（Klebsiella）下调至较H组更低水平。

表1 相关差异菌属在3组间的平均丰度

5 功能预测

为预测并比较3组间肠道菌群功能，采用PICRUS软件将3组数据与KEGG数据库进行比较，得到Level 3层级功能注释信息，并用Dunn`s test检验肠道菌群预测功能在组间是否有显著性差异（P＜0.05，表2）。结果 显示：E组与H组相比，脂多糖生物合成显著增强，并在GXD干预后减弱；而甲状腺激素信号传导通路、多巴胺能突触功能、逆行性的内啡肽信号传递功能及羟色胺能突触功能在GXD干预后显著增强。

表2 KEGG L3功能预测及组间差异

讨 论

肠道中细菌的类型和数量的变化可能导致发展为不同的疾病[11]，如高血压、糖尿病、肿瘤等[12-14]。中药在调节肠道菌群方面优势巨大，有实验表明，许多低血药浓度的中药成分在肠道的聚集浓度非常高，其与肠道菌群之间的关系密不可分[6]。越来越多的学者注意到肠道微生态的平衡理论与“调和阴阳，扶正祛邪”的中医理论不谋而合，即扶植肠道内的益生菌，抑制有害菌和致病因子，对增强人体双向调节能力、提高免疫力及维持身体健康发挥重要作用[15]。本课题组在前期已证明GXD治疗MPS相关症状有良好的疗效，并认为GXD可能通过调节肠道菌群发挥作用[16]。

1 MPS患者肠道菌群特征及GXD干预作用

在Alpha多样性上，AE组的Chao1指数、Simpson指数及Shannon指数均显著高于E组，而与H组无差异，说明在GXD干预后，MPS患者的肠道菌群在多样性及丰富度上均有升高，并与绝经前后健康女性水平趋于一致。Beta多样性分析也显示出MPS患者在GXD干预前后的肠道菌群多样性有显著差异，即GXD能对MPS患者肠道菌群的多样性和丰富度产生有效干预作用。

从门水平上分析3组肠道菌群的物种组成，本研究结果发现，虽然丰度前三的优势菌群相同，但在不同分组中的丰度所占百分比仍有不同。与MPS患者相比，AE组厚壁菌门（Firmicutes） 相对丰度升高而拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度降低，与H组水平相近。F/B是评价肠道菌群失调的指标[17]，在GXD干预后能上调MPS患者肠道菌群F/B值改善肠道菌群失调状态。

在属水平上，我们发现3组肠道菌群的结构出现显著差异，故采用LEfSe分析及组间DESeq2进一步筛选3组之间的差异肠道菌群，并观察GXD干预后对相关差异菌群的影响。直肠真杆菌属（Agathobacter）和经粘液真杆菌属（Blautia）均被证实是人体转化黄酮类化合物的重要肠道菌群[18-19]，两者丰度均在GXD干预后出现上调，其中经粘液真杆菌属（Blautia）在AE组中丰度显著升高。近期研究发现，经粘液真杆菌属（Blautia）有益生菌样特性[20]，还能在厌氧条件下转化淫羊藿苷，将其代谢为去甲基淫羊藿苷，作用于雌激素受体表现出雌激素作用[19]。GXD方中淫羊藿、知母等富含淫羊藿苷[21-22]，故GXD上调经粘液真杆菌属（Blautia）丰度可能是减轻雌激素水平降低引起的MPS相关症状的原因之一。另外，Golubeva AV等[23]发现经粘液真杆菌属（Blautia）与结肠中表达的L-色氨酸羟化酶（Tph1）、5-羟色胺（5-HT）转运体（Sert）和血红素酶（Ido1）基因水平之间有很强的相关性：与Tph1基因、Ido1基因呈显著正相关；与Sert基因呈显著负相关。因此，经粘液真杆菌属（Blautia）丰度上调可能引起Tph1基因和Ido1基因表达增多，增强人体肠道内L-色氨酸、5-羟色氨酸（5-HTP）和5-HT的生成和转化；同时降低Sert基因表达，减少神经突触对5-HT的重摄取，相对增加血清中5-HT水平。已有研究证明5-HT与情绪、体温调节及血管收缩有着密切的关系[24-25]，而MPS患者常伴有潮热及情志异常（焦虑、抑郁）[2]，故GXD可能通过上调经粘液真杆菌属（Blautia）丰度，增强人体对L-色氨酸、5-HTP和5-HT的吸收和利用度，以改善MPS患者潮热症状及情志异常。

绝经前后女性脂肪含量显著增加，呈向心性分布，而这已被证实与心血管疾病风险增加有关[26-27]。本研究发现GXD干预后可调整MPS患者体内与脂肪合成相关的肠道菌群。霍尔德曼氏菌属（Holdemanella）被证实与女性脂肪比率呈负相关[28]；嗜胆菌属（Bilophila）是机会致病菌，与肠道炎症的加重有密切的关系[29]，其中隶属于嗜胆菌属（Bilophila）的wadsworthia菌种被证实能与高脂肪饮食协同促进更高的炎症反应，并能促进脂肪肝的发生[30]。而在GXD干预后能升高MPS患者肠道中的霍尔德曼氏菌属（Holdemanella）丰度，降低嗜胆菌属（Bilophila）的丰度，故GXD可能通过调整上述2种肠道菌群在MPS患者肠中的丰度，减少脂肪生成，降低罹患心血管疾病的风险。

此外，GXD有降低MPS患者肠道致病菌的作用，如克雷伯氏菌属（Klebsiella）、嗜血杆菌属（Haemophilus）等[31]在GXD干预后丰度降低，能减少其对身体的毒害作用。

2 GXD调节MPS患者肠道菌群的机体代谢途径

脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，作为一种非特异性抗原，会与宿主效应细胞（主要为巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞）相互作用，分泌一系列生物活性分子，使机体内环境处于紊乱状态[32]。本研究对3组肠道菌群的PICRUS功能预测发现，MPS患者肠道菌群的脂多糖合成功能显著增强，可能由于肠道中革兰氏阴性细菌的异常增多，导致脂多糖过多合成，加重患者内环境紊乱程度，而该功能在GXD干预后减弱。因此GXD可能通过调整肠道菌群，减少脂多糖合成，改善MPS相关症状。

在GXD干预后甲状腺激素信号传导通路、多巴胺能突触功能、逆行性的内啡肽信号传递功能、羟色胺能突触功能显著增强。甲状腺激素会降低胆固醇和血压[33]，且正常的甲状腺功能对减少腹部肥胖和胰岛素抵抗有重要作用[34-35]；抑郁症的许多症状如快感缺乏与多巴胺系统功能障碍有关[36-37]；内啡肽现在被证明可以诱导欣快感，并能改善潮热症状[38]。故GXD可能通过调整MPS患者肠道菌群结构，进而增强上述通路，改善MPS相关症状。

3 研究意义及展望

本研究运用16S rRNA测序技术，发现MPS患者肠道菌群的结构特征异于绝经前后健康女性，出现了明显的肠道菌群失衡。使用GXD干预后能显著调整MPS患者肠道菌群结构，并预测出其可能增强部分有益通路功能，为探究GXD治疗MPS机制提供了新证据。本研究尚存在一定的不足，如临床上收集的样本量较少，可能影响结果的代表性；也缺乏实验验证菌群与MPS的直接关系。我们将进一步扩大样本量进行测序分析，并通过实验室研究GXD干预后筛选出的关键差异菌群对MPS相关症状的影响和作用机制。