淫羊藿苷对锰致小鼠精母细胞死亡的抑制作用*

贺佳琪，田春花，胡元梅，蔡仁莲，檀军，陆祥，田莹

1 遵义医科大学，组织学与胚胎学教研室 贵州遵义 563000

2 遵义医科大学，形态学实验室 贵州遵义 563000

锰，广泛存在于自然界中，常见于以化合物的形式存在，在地壳内其平均含量为0.1%，是已知元素的第十五位[1]。其在机体正常发育、脂类、氨基酸和葡萄糖代谢及细胞能量调节中发挥着重要作用[2]。锰是国民经济中重要的基础物资和国家重要战略资源之一，我国是全球最大的锰生产国、消费国和出口国，锰矿在西南地区主要分布于重庆和贵州等地[3]。但近年来，随着无铅汽油、农药代森锰等的广泛使用，以及锰矿的开采、锰合金的冶炼、电焊时的大量烟尘，造成环境中锰的含量逐渐升高，增加了普通人群接触锰的机会，导致锰在体内的浓度失衡[4]，诱发诱发严重不可逆的精神和锥体外系运动功能障碍，出现帕金森综合征的临床表现，过量锰进入人体也会影响生殖功能[5]。研究显示，锰可使男工的生殖能力减弱，其妻子自然流产率和死胎率可随着其丈夫接触锰时间的增加而升高[6]。国发[2022]2号文件指出“实施磷、锰、赤泥、煤矸石污染专项治理……”可见国家对锰污染危害的重视。

淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim，EbM），别名仙灵脾，是临床常用的传统补益中药。据《中华人民共和国药典》（2020版）记载，EbM主要功能有温补肝肾、强健筋骨、祛风湿等[7]。研究表明，EbM主要含有黄酮类、多糖类、挥发油、生物碱及钾、钙、镁等多种微量元素，具有清除自由基、抗氧化、抑制DNA损伤、调节雄性生殖功能的作用，其主要活性成分为淫羊藿苷（Icariin，ICA）[8]。研究报道，ICA可通过抵抗氧化损伤、抑制生精细胞凋亡来改善由尼古丁、酒精所致的睾丸损伤，但是，ICA能否抑制锰诱导的生殖细胞损伤？本文在前期对锰影响生殖功能研究的基础上，对小鼠精母细胞GC-2spd（ts）进行一定剂量的锰染毒，探讨ICA对锰致生殖损伤是否具有修复作用，为锰致不育症及生殖损伤的治疗提供实验依据。

仪器与材料

1 实验仪器

CO2细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，美国，型号：Forma3121）；生物安全柜（Midea，中国，型号HR60-ⅡA2）；酶标仪（SpectraMax M2，MolecuLar Devices，美国）；倒置相差显微镜（Olympus Corporation，日本，型号：CKX53）。

2 材料

GC-2spd（ts）细胞株购自中科院细胞库；ICA（纯度98.61%，批号：160920）购自成都植标化纯生物技术有限公司；MTT（货号：ST316）、二甲基亚砜溶液（DMSO，货号：ST038）均购自上海碧云天生物技术有限公司；DMEM（货号：8121045）、胰酶均为美国Gibco公司产品；胎牛血清为杭州四季青产品；甲醇（分析纯）。

3 实验方法

3.1 药物配制 称取3.38 mg ICA粉末溶于100 μL甲醇中，在37℃水浴箱中加热5 min后，在摇床上震荡，待ICA完全溶解，即配制500 μmol/L ICA（母液），取母液稀释使用，ICA在细胞培养液中终浓度为0.05、0.5、5、50 μmoL/L。

3.2 细胞染毒 GC-2spd（ts）采用DMEM高糖培养基（含1% Glutamax，100 mmoL/L Sodium Pyruvate Solution），添加10%胎牛血清，置于37°C、5% CO2培养箱中培养，分为空白对照组（Control）、阴性对照组（含等体积溶剂甲醇）、锰染毒模型组（MnCl2）、淫羊藿苷组（ICA）、淫羊藿苷干预组（ICA+MnCl2）、溶剂与淫羊藿苷组（甲醇+ICA），每一组设置5个复孔，实验重复三次。参考前期预实验摸索的MnCl2作用于GC-2spd（ts）细胞24 h、72 h的IC50加MnCl2（24 h的IC50为5.23×10-3mol/L，72 h的IC50为3.23×10-4mol/L）。3.3 MTT法检测GC-2spd（ts）细胞活力 将对数生长期的GC-2spd（ts）细胞制成细胞悬液，用血球计数板进行细胞计数，接种至96孔板中，每孔100 μL，接种细胞数量为每孔5×103个，每一组设置5个复孔，实验重复三次[9]，于37℃、5% CO2培养箱中培养，48 h后，向每孔分别加入10 μL MTT试剂（5 mg/mL），避光培养4 h后[10]，弃上清，每孔分别加入100 μL DMSO，振荡5 min，再放入培养箱继续培养30 min，以 确 保 结 晶 充 分 溶 解。甲瓒充分溶解后用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测量吸光度（OD）值[11]，计算各组细胞存活率。细胞存活率（%） =（实验组OD值-空白组OD值） /（对照孔OD值-空白组OD值） × 100% 。

4 统计学分析

所有数据采用GraphPad Prism 8.3.0进行统计分析，数据均以均值±标准误表示，组间采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度的ICA对GC-2spd（ts）细胞增殖活性的影响

MTT法检测用甲醇溶解的不同浓度（0.05、0.5、5、50μmol/L）ICA处理的GC-2spd（ts）细胞，在作用48 h之后检测细胞存活率。甲醇组的存活率为（99.40±2.24）%，0.05、0.5、5、50 μmol/L ICA干预组的GC-2spd（ts）存活率为（108.04±4.83）%、（111.86±3.67）%、（106.43±3.67）%、（115.58±2.95）%，上述结果显示，与空白对照组相比，虽然各浓度ICA干预组的细胞存活率都略高于对照组，但只有50 μmoL/L ICA具有统计学意义（P＜0.05），其中，ICA浓度为5 μmoL/L时，细胞存活率略低，ICA浓度为50 μmoL/L的时候，细胞存活率相对较高，表明50 μmoL/L ICA可促进小鼠精母细胞GC-2spd（ts）增殖。

2 ICA作用48 h对MnCl2诱导GC-2spd（ts）细胞死亡的抑制作用

MnCl2组与空白对照组相比细胞存活率显著下降（P＜0.05），锰染毒组加入溶剂（甲醇）以及不同浓度ICA（0.05、0.5、5、50 μmol/L）进行干预，发现ICA对于MnCl2损伤的GC-2spd（ts）细胞有显著的修复作用（P＜0.05）。其中，甲醇组的存活率为91.59±3.41%，MnCl2染毒组的存活率为（8.31±0.70）%，0.05、0.5、5、50 μmol/L ICA干预组的GC-2spd（ts）细胞存活率分别为（79.48±1.87）%、（81.58±1.51）%、（75.68±1.98）%、（68.87±1.58）%，MnCl2与甲醇共同作用组的存活率为（64.66±2.60）%。上述结果表明，各浓度ICA干预组的细胞存活率都高于MnCl2组，差异显著（P＜0.05），其中，ICA浓度为0.5 μmol/L时，细胞存活率最高，ICA浓度为50 μmol/L的时候，细胞存活率相对较低。

图1 ICA作用48 h对GC-2spd（ts）细胞存活率的影响

图2 ICA作用48 h对MnCl2诱导GC-2spd（ts）细胞死亡的抑制作用

讨 论

锰在自然界中分布广泛，随着我国锰矿开采，锰中毒所带来的问题也随之而来。研究表明，锰对性功能有一定的影响，主要体现在性欲减退、排精障碍、早泄、阳痿等；锰矿工人的妻子流产率、死胎率在上升。锰可使细胞产生大量自由基，损伤线粒体，致使ATP合成明显减少或使上调促凋亡蛋白表达而诱导细胞凋亡[12]。但目前尚无有效的预防及治疗措施。

淫羊藿苷（ICA）对下丘脑-垂体-性腺轴功能、性激素生成、性器官及性功能有一定促进作用，可以促进睾酮合成、促进精子生成并改善精子生成的微环境。ICA对男性生殖系统损伤具有保护作用，可改善环磷酰胺诱导大鼠睾丸生精障碍[13]、酒精致雄性小鼠生殖损伤[14]，以及改善 GC-1细胞DNA氧化损伤[15]，其还可促进阴茎勃起，治疗早泄等[16]。但ICA对于锰致的生殖损伤是否有修复作用，目前尚未见报道。

本课题组前期研究发现高剂量锰对于生精母细胞GC-2spd（ts）有损伤作用，基于此，我们进一步探究ICA对锰致精母细胞GC-2spd（ts）的损伤是否具有修复作用。研究结果表明，锰染后GC-2spd（ts）细胞皱缩、漂浮，使用ICA进行干预后，GC-2spd（ts）细胞恢复正常，且细胞存活率得到明显提高。研究表明，九香虫提取物对MnCl2致生殖损伤具有一定修复作用，可能是通过抑制凋亡相关基因如Bax、Cyt c以及Caspase 3的表达从而抑制其凋亡，但ICA对MnCl2致生殖损伤修复作用的机制尚不明确，可进行深入的研究，本文所使用的小鼠的精母细胞GC-2spd（ts）转染了SV40大T抗原基因，其p53抑癌基因（温度敏感）发生突变，该细胞经过G418筛选，已丧失其分化潜能，处于减数分裂前期，故可利用该细胞在体外进行生殖损伤修复研究。但其与精母细胞在体内生长的状态仍有所不同，后期还需进一步利用动物模型开展体内生殖损伤修复实验研究。本文研究发现，MnCl2与甲醇共同作用组相较于MnCl2组细胞存活率有显著升高，推测其成分可能对MnCl2的生殖毒理作用有影响，但具体机制尚不明确，可进行深入研究，此外，还可进一步选择DMSO、甲醇、羧甲基纤维素钠溶解ICA进行生殖损伤修复实验。以期为锰致生殖损伤的预防、治疗提供参考。