益母草碱可溶性微针的制备与初步研究

陈健敏，蔡小真，朱丹虹，李金兰，陈科元

（1.莆田学院药学与医学技术学院，莆田 351100；2.药物分析与检验医学福建省高校重点实验室，莆田 351100；3.中药质量研究国家重点实验室，澳门科技大学，澳门 999078）

益母草碱（leonurine)是从益母草中提取出来的一种有机胺类生物碱，具有广泛的药理活性，包括抗血小板聚集、抗纤维化、抗氧化、抗炎镇痛、降血脂、保护神经和心肌等[1-2]。然而，目前益母草碱的相关制剂研究仍然处于临床前或临床研究阶段，尚未有上市产品。临床和临床前研究主要聚焦于益母草碱的口服制剂，但因其半衰期较短，肠道首过效应（intestinal first pass effect，消除90%的益母草碱)等导致益母草碱绝对口服生物利用度非常低（大鼠为4.2%，狗为7.0%)，严重限制了口服制剂在临床上的应用[3]。注射剂可不经过胃肠道代谢直接进入体循环，生物利用度较高，但注射时会引起疼痛和创伤，而且益母草碱水溶性差难以制成针剂，广泛应用也受到一定限制。因此，开发满足临床需要的益母草碱的新剂型，对其临床应用具有深远的意义。

经皮给药系统（transdermal drug delivery systems，TDDS）是指药物通过皮肤吸收，在局部或全身达到有效血药浓度，实现预防或治疗疾病的一种给药方式[4]。与传统给药方式（口服和注射）相比，经皮给药系统具有很多优势，例如能避免肠道和肝脏的首过效应，使用安全方便，无痛无创口等，在临床上越来越受到患者的青睐[5]。然而，目前临床上可用于经皮给药的药物并不多，主要因为传统乳膏剂以及现代骨架型、膜控型贴剂等受皮肤角质层的屏障作用，大部分药物经皮渗透的速率和效率较低[6-7]。益母草碱的水溶性差，较难通过皮肤屏障从而导致治疗效果不理想[8]。可溶性微针（dissolving microneedles)是结合了皮下注射和经皮给药二者优势的一种新型经皮给药载体，是由针状突起物排列而成的阵列，每根突起物长约为25～1 000 μm[9]。它将药物包埋在针状突起物内，通过穿透角质层，形成小孔道[10]，打破角质层的屏障作用，药物直接进入皮内，大大提高药物的经皮吸收率[11]。可溶性微针的尺寸微小，不易触及皮下神经，因此不会引起明显的疼痛感；穿刺形成的细微通道可以在数小时内自动愈合，不会造成出血和创伤；使用简单方便，患者可以在家自行给药[12]。正因为这些优势，可溶性微针已成为解决难溶性药物经皮递送难题的有效载体。本文制备益母草碱可溶性微针来促进药物的经皮吸收，通过考察微针的形态特征、力学强度、体外溶出、皮肤吸收率和皮肤安全性等指标，初步建立益母草碱可溶性微针给药体系，为其经皮给药制剂的研发提供理论基础和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂 益母草碱（>98%)获赠于中药质量研究国家重点实验室（澳门科技大学)；聚乙烯醇（PVA)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、罗丹明B、亚甲基蓝、三氯乙醛、无水乙醇、甲醇、磷酸二氢钠·二水和磷酸氢二钠·十二水均为分析纯，购于上海晶纯生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 微针力学强度测试仪（艾得堡仪器，Handpi-NK-50）、电子天平（上海卓精科技有限公司，BSM）、电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司，DHG-9240B）、智能透皮仪（北京新诺华仪器有限公司，YB-P6）、单反数码相机（佳能，700D）、高效液相色谱仪（美国Agilent Technologies 公司，1200 series）、体视显微镜（深圳赛克数码科技开发有限公司，SK2500TSH）。

1.3 实验动物与皮肤模型 动物相关的方法与试验步骤均严格按照莆田学院动物伦理委员会的批件[2020（30）]执行。雄性Sprauge-Dawley（SD）大鼠（200±10）g 购于福建省闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司，饲养在12 h 明暗循环，温度为（22±1）℃，相对湿度为40%～60%的动物房中。大鼠离体皮肤模型制备流程如下：大鼠用5%水合氯醛溶液（剂量为0.7 mL/100 g）麻醉处死，再进行脱毛处理，取腹部皮肤，去除皮下脂肪后，用pH 7.4 的磷酸缓冲溶液（PBS）洗净，分装于自封袋中，放入冰箱冷冻室（-20℃）储藏备用。

1.4 分析方法的建立 参考文献中的方法[13]，采用高效液相色谱法检测样品中的益母草碱含量，具体检测条件如下。色谱柱：Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相:甲醇∶水=70∶30；流速:1.0 mL/min；检测波长：277 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。标准溶液的配制：精密称取益母草碱30 mg ，用甲醇定容至250 mL 容量瓶中，配成120 μg/mL 的益母草碱储备液。用甲醇将储备液分别稀释成浓度为3.75、7.50、15.00、30.00、60.00 和120.00 μg/mL 的系列标准溶液。按以上色谱条件进样测定，记录峰面积。以益母草碱标准溶液的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制线性回归曲线，获得标准曲线方程：Y=35 769X-90 856，R2=0.999 4，结果表明益母草碱在浓度范围3.75～120.00 μg/mL 内有良好的线性关系。

1.5 微针的制备及含量测定 益母草碱可溶性微针的制备参考本课题组之前的方法[14]，分为普通可溶性微针（common dissolving microneedles，CDMNs）和针体载药微针（tip loaded dissolving microneedles，TDMNs）2 种制备方法，如图1 所示。分别配制含0.1%和0.2%益母草碱的高分子溶液（5%PVP+5%PVA），按以下流程制备CDMNs:将含药的高分子溶液按一定量加入PDMS 微针模具中，然后离心让溶液进入模具微孔，再加入适量的溶液（总体积为500 μL），干燥脱模后得到针体和背衬均含药的CDMNs。分别配制含1%和2%益母草碱的高分子溶液（5%PVP+5%PVA），按以下流程制备TDMNs：将含药的高分子溶液50 μL 加入PDMS 微针模具中，然后离心让溶液进入模具微孔，溶剂挥发后，再加入适量的不含药的高分子溶液（15%PVP+15%PVA），干燥脱模后得到针体含药的TDMNs。为了考察药物在CDMNs和TDMNs 两种类型微针针体的分布情况，用刀片小心地将微针针体切下，分别将切下的针体和残留的背衬溶解于适量PBS 中，采用高效液相色谱法检测其中的益母草碱的含量。

图1 益母草碱可溶性微针制备流程示意图Fig 1 Schematic diagram of leonurine soluble microneedle preparation process

1.6 微针的力学强度及穿刺能力表征 采用PVP和PVA 混合物作为基质材料制备的CDMNs 已被本课题组证实具有足够的力学强度和穿刺能力[15]。因此，本部分采用本课题组之前报道的方法[16]，只对TDMNs 进行力学强度测试。简单来说，将TDMNs 针体朝上置于微针力学强度测试仪的测试台上，用铝制平底探头（直径10 mm)以0.5 mm/min 的恒定速度垂直向下移动至微针的尖端，记录位移和力值，直至达到预设的最大位移（0.5 mm)。当作用力达到5、10、15、20、25、30 、35 和40 N 时，用相机观察并拍摄TDMNs 的形貌变化。为了测试TDMNs 体外穿刺能力，开展了铝箔纸穿刺试验和鼠皮穿刺试验。将铝箔纸（厚度:10 μm)放置在PDMS 微针模具上，再将TDMNs 置于铝箔纸上，然后在其背部施加适当的压力保持1 min，取出铝箔纸放置于白纸上，用2%亚甲基蓝溶液涂抹铝箔上的微孔，观察染色液是否通过微孔而使白纸染色，最后用相机拍照记录。取出冷冻保存的离体大鼠皮肤，用PBS 浸泡1 h 使其恢复活性，将皮肤垫在柔软的橡胶片上，将TDMNs置于鼠皮上，用拇指按压1 min 后取出TDMNs，鼠皮用2%亚甲基蓝溶液染色1 min，观察并拍照。按以下公式计算TDMNs 的穿刺效率（penetration efficiency，PE)，PE%=（染色孔数/微针数）×100%。

1.7 微针的体外溶出和模拟皮肤释放 采用本课题组之前报道的方法研究益母草碱的体外溶出[17]，步骤如下：用双面胶将CDMNs 或TDMNs 固定在塑料片上，然后针体朝下扣在Franz 透皮杯的接收池上，再将给药池扣在塑料片上，夹上马蹄铁，然后往接收池中加入PBS 溶液。将Franz 透皮杯置于水浴中（37℃)，磁子以350 r/min 的速度搅拌，开始实验。在试验开始后的0.5、1、2、4、8 和16 min，分别从接收池中取出全部溶液，并立即加入等量的PBS。为了模拟药物在皮肤中释放，采用目前评价可溶性微针体外释放的较为合理的方法[18]，以Parafilm 作为皮肤模型，将微针刺穿Parafilm 后形成一个半封闭体系，再按体外溶出试验步骤进行实验。在实验开始后的1、2、3、4 和5 h，从接收池中取出全部溶液，并立即加入等量的PBS。所有实验至少重复3 次（n=3)，所得样品均采用高效液相色谱法进行检测。计算每个时间点的药物累积释放量，再将其对时间作图。

1.8 微针的皮肤溶解及经皮释放 将活化的鼠皮平铺在柔软的橡胶板上，用拇指按压微针使其刺入皮肤，然后将微针和鼠皮一起放置于1%的琼脂上，以防止鼠皮水分过度流失而干燥变硬，更好的模拟体内环境；分别在15、30 、60 min 后取出微针，在显微镜下观察并拍照记录。采用智能透皮仪研究CDMNs（或TDMNs）的经皮释放规律，具体步骤如下：将CDMNs 刺入皮肤后，将其和皮肤作为一个整体放置在接收池上，用透明胶带固定，再扣上给药池，夹上马蹄铁，然后往接收池中加入PBS 作为接收液。将Franz 透皮杯置于水浴中（37℃)，磁子以350 r/min 的速度搅拌，开始试验。在实验开始后的1、3、6、12 和24 h，从接收池中取出全部溶液，并立即加入等量的接收液。试验结束后，先用刮刀将鼠皮表面残留的CDMNs 刮取，鼠皮表面再用接收液清洗，二者合并后，用适量接收液稀释后待测。皮肤对药物的吸收率=（A-B）/A×100%，其中A 为微针中总药量；B 为未进入皮肤的药量。200 μL 含益母草碱500 μg 或1 000 μg 的悬浊液（含0.1% 羧甲基纤维素钠）作为对照组，按上述步骤操作。

1.9 体内皮肤水分流失（TEWL）实验 一般来说，皮肤若受损严重则表现出较高的TEWL 值，如果受损程度较小或皮肤完整则表现出较低的TEWL 值，因此可以利用TEWL 值的大小评价皮肤的受损程度和愈合情况[19]。在实验前1 d，利用剃毛刀将雄性大鼠腹部皮肤的毛发剃除，残留毛发再使用脱毛膏处理。采用水合氯醛麻醉大鼠后，将TDMNs 作用于腹部皮肤，5 min 后移除，采用经皮水分流失测试仪记录每个固定时间点（0、10、30 min、1、2、3、4、5 和6 h）的经皮水分流失（transepidermal water loss，TEWL）情况，并用单反数码相机记录大鼠腹部皮肤的恢复情况。将靠近TDMNs 作用位点的临近部位皮肤作为空白对照。实验重复3 次（n=3)，TEWL 值以g/（m2·h)表示。

1.10 统计学处理 每个试验至少重复3 次（n=3)，结果用±s 表示。采用单因素方差分析（ANOVA）和学生t 检验对有关数据进行统计学分析，P<0.05 被认为具有显著性差异。

2 结果

2.1 微针形貌表征及剂量控制 干燥脱模后，得到背衬平整、针型完整、针体形态饱满的12×12 阵列（长宽为10 mm×10 mm)的CDMNs，每片微针阵列上有144 根针体，如图2A 和2C 所示。每根针体为四棱锥形，棱锥高为680 μm，各针体之间的间距为600 μm。针体顶部的横切面为四边形，两边长约20 μm和10 μm，针体顶部面积约为200 μm2。为了更清楚的展示TDMNs 中药物的分布，在含药的高分子溶液中加入0.01%的罗丹明B，所制备的TDMNs 如图2B 和2D 所示。TDMNs 的各个形貌特征均与CDMNs 相同，但药物主要集中在微针的针体上，证明通过不同的工艺能够将药物富集在针体上。

图2 CDMNs 和TDMNs 的形貌特征Fig 2 Morphological characteristics of CDMNs and TDMNs

为掌握微针的制备工艺对药物分布的影响，对CDMNs 和TDMNs 的针体和背衬的载药量情况进行了分析，结果如表1 所示。0.1%CDMNs 的针体载药量（tip drug loaded）和背衬载药量（backing drug loaded）分别为（9.88±2.36)和（475.04±18.14）μg，二者之和为实际载药量（actual drug loaded）（484.92±16.68）μg；理论载药量（theoretical drug loaded）为500 μg，由此计算载药效率（drug loading efficiency）为（96.98±3.33）%。1%TDMNs 的针体载药量和背衬载药量分别为（456.85±14.82）和（31.49±3.12）μg，载药效率为（97.67±3.68）%。因0.1%CDMNs 和1%TDMNs 的投入总药量相同，载药效率方面没有显著差异，但是药物在针体和背衬中的分布大大不同。1%TDMNs的针体载药量是0.1%CDMNs 的46 倍，表明TDMNs能够有效地将药物富集在针体上，但因扩散作用，也有少量药物分布在背衬中。当投药量翻倍后，TDMNs和CDMNs 针体和背衬载药量均按比例增加，表明可以通过控制投药量来准确控制微针中的药物剂量。

表1 不同类型微针中的药物分布和载药效率（ ±s）Tab 1 Drug distribution and drug loading efficiency in different types of microneedles（ ±s）

表1 不同类型微针中的药物分布和载药效率（ ±s）Tab 1 Drug distribution and drug loading efficiency in different types of microneedles（ ±s）

组别 针体载药量（μg) 背衬载药量（μg) 实际载药量（μg) 理论载药量（μg) 载药效率（%)0.1%CDMNs 9.88±2.36 475.04±18.14 484.92±16.68 500 96.98±3.33 0.2%CDMNs 24.35±4.28 958.03±27.25 992.26±24.33 1 000 99.23±2.43 1%TDMNs 456.85±14.82 31.49±3.12 488.34±18.43 500 97.67±3.68 2%TDMNs 913.71±26.38 72.54±5.66 986.25±22.64 1 000 98.62±2.26

2.2 微针的力学强度和穿刺能力 用微针力学强度测试仪对2%TDMNs 的力学强度进行测试，结果如图3A 所示。TDMNs 在20 N 及以内的作用力下，没有发现明显的变形，表明TDMNs 能够承受至少20 N 的作用力；每片微针共有144 根针体，即每根针体能承受至少0.14 N 的压力。随着作用力的增大，TDMNs 的针体逐渐发生弯曲，但未发现微针折断的情况，表明它有足够的韧性。以铝箔模拟皮肤进行穿刺实验，结果如图3B 所示，在铝箔上形成了微孔阵列。通过这些微孔，可以将亚甲基蓝溶液染色到白纸上，如图3C 所示，表明TDMNs 有效穿刺铝箔，确实形成了144 个孔道，穿刺效率PE 为100%。TDMNs 作用于鼠皮的结果如图3D 所示，微针针体有部分溶解，同时在鼠皮上留下了144 个微孔，亚甲基蓝染色后每个孔都有着色，同时，在显微镜下可看到明显的鼠皮被穿透后留下的孔洞，PE 为100%，表明微针有足够的硬度可以穿刺皮肤、突破角质层。

图3 TDMNs 的力学强度测试及穿刺实验Fig 3 Mechanical strength test and puncture test of TDMNs

2.3 微针的体外溶出和在模拟皮肤中释放 CDMNs和TDMNs 的体外溶出实验结果如图4A 和4B 所示。随着时间的延长，1%TDMNs 中释放的药物逐渐增加，到8 min 时已基本完全释放；0.1%CDMNs 中的药物释放更快，在4 min 时已基本完全释放。在2%TDMNs 和0.2%CDMNs 中的药物释放也发现同样的规律，主要原因可能是CDMNs 的针体和背衬都含药物，药物与释放介质接触的面积较大，药物溶出速率较快。从图4B 可以看出，在3 min 内CDMNs 和TDMNs 均有50%的药物释放，在8 min 药物释放率达到峰值，在95%左右。研究结果如图4C 和4D 所示。对比同剂量的CDMNs 和TDMNs，发现TDMNs的释放量在每个时间节点都比CDMNs 高，具有显著性差异（P<0.05），这结果与体外溶出刚好相反。例如，如图4C 所示，1%TDMNs在2 h 时已经释放约400 μg，而0.1%CDMNs 才释放约256 μg，高剂量组也发现同样的规律。导致这一现象的主要原因在于：当微针针体穿刺模拟皮肤后，只有微针的针体直接暴露在接收液中，而TDMNs 针体上的药物含量远高于CDMNs 针体上的药物，所以导致药物较快释放。从图4D 可以看出，TDMNs 在1.5 h 时释放率达到50%，而CDMNs 在2 h 时才达到50%，不同剂量的TDMNs（或CDMNs）的药物释放率基本一致，没有显著性差异（P>0.05）；然而对比TDMNs 和CDMNs，发现TDMNs 的释放率均显著（P<0.05）高于CDMNs，表明针体载药微针的药物释放率更高，更有利于药物的递送和释放。

图4 微针体外溶出和在模拟皮肤中释放Fig 4 Microneedle dissolution in vitro and release in simulated skin

2.4 微针的皮肤溶解及皮肤吸收率 TDMNs 刺入皮肤后的溶解情况如图5A 所示，发现微针刺入皮肤后随着时间的延长而逐渐溶解，在30 min 时溶解接近一半，而到60 min 针体基本溶解完全。这表明TDMNs作用于皮肤至少需要停留60 min，才能保证药物的有效释放。TDMNs 和CDMNs 的经皮释放规律如图5B 和5C 所示，TDMNs 药物的释放速率和释放量均高于同等剂量的CDMNs，而同等剂量的悬浊液各个时间点的药物浓度均低于检测限，故无数据展示。如图5B 所示，0.1%CDMNs 在1、3、6、12 和24 h 的释放量均显著低于1%的TDMNs（P<0.05），24 h 的累积渗透量为143.40 μg，只有TDMNs 的60%（241.64 μg）；0.2%CDMNs 在1、3、6、12 和24 h的释放量均显著低于2%的TDMNs（P<0.05），24 h的累积渗透量为236.08 μg，只有TDMNs 的50%（467.06 μg）。从图5C 可以看出，TDMNs 的药物递送效率均显著高于CDMNs（P<0.05），而同类型的微针之间没有显著性差异（P>0.05）。通过测试未进入皮肤的残留药量，进一步获得1%TDMNs、2%TDMNs、0.1%CDMNs 和0.2%CDMNs 的药物皮肤吸收率分别为（64.73±6.37）%、（63.83±5.92）%、（33.54±3.67）%和（27.26±2.42）%。一般透皮贴片的皮肤吸收率为3%～5%[20]，CDMNs 的吸收率是传统的10 倍左右，而TDMNs 则高出了将近20 倍。

2.5 经皮水分流失及皮肤愈合情况 TDMNs 作用于大鼠腹部皮肤后，测试TEWL 值并记录皮肤的恢复情况，结果如图6 所示。图6A 表明，当TDMNs 作用于大鼠皮肤后，皮肤的TEWL 值升高到（43.5±2.12）g/（m2·h），是空白对照组[（8.9±1.56）g/（m2·h）]的4.9 倍；从图6B 可以明显看出，微针作用后在皮肤表面形成了数百个微孔。随着时间的延长，TEWL 值逐渐下降，但在4 h 之前，TDMNs 的TEWL 值仍然显著高于空白对照组（P<0.05），表明皮肤在逐渐的愈合；从图6B 也可以看出微针作用形成的微孔逐渐愈合。当时间延长至5 h 后，TDMNs 的TEWL 值[（11.25±1.36）g/（m2·h）]与空白对照组[（10.25±1.27）g/（m2·h）]已经没有显著性差异（P>0.05），表明皮肤的角质层已基本恢复了屏障作用；6 h 时TDMNs 的TEWL 值已恢复正常水平。另外，在6 h 后，皮肤上的微孔也已肉眼不可见，而且没有明显的红肿现象。

图6 经皮水分流失及皮肤愈合情况Fig 6 TEWL and skin healing

3 讨论

本文成功制备了2 种类型的益母草碱可溶性微针，并对其基本理化性质和经皮给药特性进行了表征和研究。制备可溶性微针的材料可分为韧性材料和脆性材料2 类，研究表明韧性材料制得的微针平整度不理想，且产生皱缩现象，而脆性材料制备出来的微针有较大的硬度但容易断裂，使用单一材料制备的微针都存在一定缺陷[21]，同时有研究证明皮肤穿透所需的力小于0.1 N/针[22]，而本文制得的两种可溶性都采用了PVA（韧性材料）和PVP（脆性材料）混合材料作为基质，使其具有足够的韧性和强度，并且TDMNs 每根针体能承受至少0.14 N 的压力，表明了本文所制备的微针有足够的力学强度且能有效地刺入模拟皮肤和大鼠皮肤。微针中的益母草碱能有效地在不同媒介中释放，而TDMNs 在大鼠皮肤中的吸收率高达63%左右，表明了TDMNs科研大大促进了益母草碱的经皮吸收，而益母草碱在高血脂小鼠模型改善实验中的高剂量为20 mg/（kg·d）[23]，小鼠按20 g 计算，每次给药只需要益母草碱400 μg，因此一片TDMNs 即可满足动物实验的剂量要求，该研究的结果为接下去的动物实验提供了基础数据支撑。当TDMNs 作用于大鼠皮肤后，皮肤的TEWL 值升高，表明微针打破了皮肤的角质层的屏障作用，在5～6 h 后皮肤的TEWL 值即恢复到正常水平，且未发现明显的红肿现象，表明皮肤已恢复完整性，这些结果都与文献报道的结果一致[24-25]，同时表明了TDMNs 对于皮肤是相对安全的。以上结果表明，本文制备的益母草碱可溶性微针是一种有潜力的新型经皮给药制剂，为益母草碱的临床应用提供了新的思路和途径。接下来本课题组将研究益母草碱可溶性微针的药动学，并构建高血脂动物模型开展药效学研究。