左西孟旦对脓毒症心肌损伤小鼠的保护作用及机制研究

柴鹏程，韩海波，胡振杰，陈玉红

（1.河北医科大学临床学院，石家庄 050020；2.河北医科大学第四医院重症医学科，石家庄 050011）

脓毒症是指机体对感染反应失调引起的器官功能障碍的一种疾病，常可危及生命，是重症医学常见的急危重症，病死率高达30%[1]。脓毒症心肌损伤（septic myocardial injury，SMI）是导致脓毒症患者死亡的主要原因之一。根据研究调查结果显示，脓毒症患者会出现不同程度的心肌损伤，其中40%～50%的患者出现心肌抑制，7%左右的患者出现心力衰竭，未合并心脏损伤患者病死率约为20%，合并心脏损伤患者死亡率大于70%[2]。

SMI 的发病机制目前并未完全阐明，大量动物实验研究证实，炎症、氧化应激以及心肌细胞线粒体能量代谢障碍是SMI 进而影响心肌功能的主要原因[3]。左西孟旦（levosimendan，Levo）是一种钙离子增敏剂，具有良好的正性肌力和扩血管功能。此外，Levo 还显示出其他重要的非正性肌力作用，包括抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。临床研究证实，Levo 可通过改善心力衰竭患者线粒体氧化平衡，达到心脏保护作用[4]。由此笔者提出假设，Levo 可能会通过影响SMI 小鼠的心肌细胞线粒体功能进而发挥心脏保护作用，本实验进一步研究Levo 对SMI 的作用机制，以期对其临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组及给药 清洁级雄性C57 小鼠，体重25～30 g，由北京维通利华公司提供。适应性饲养1 周，随机分为Control 组、SMI 组、SMI+Levo 组，每组6 只。自由进食和饮水1 周。SMI 组腹腔注射脂多糖（LPS）（10 mg/kg），SMI+Levo 组在给予LPS 后3 h 腹腔注射Levo（24 μg/kg），SMI 组在给予LPS 后3 h 腹腔注射同等剂量生理盐水，Control 组在0、3 h 腹腔注射同等剂量生理盐水。腹腔注射LPS 后，SMI 组与SMI+Levo 组小鼠均出现毛发竖立、精神萎靡等脓毒症表现，而Control 组无上述表现。所有实验均在河北医科大学第四医院动物实验中心完成，经过河北医科大学第四医院实验动物伦理委员会授予的项目许可（2020002）。

1.2 心脏超声测定 6 h 测定小鼠心脏功能，腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，胸前区脱毛，使用VEVO2100 超声设备（VisualSonics 公司）获取经胸二维M 型超声心动图，反复测量3 次，选取3个连续心动周期，测量计算得出左室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）、缩短分数（left ventricular fractional shortening，LVFS）及心输出量（cardiac output，CO）。

1.3 血及组织标本的采集与处理 超声测量完毕后摘眼球取血处死小鼠，留取的血标本中加入抑肽酶20 μL、10%EDTA-Na 15 μL，4℃3 000 r/min，离心15 min，取上清液-80℃保存；快速留取小鼠心脏，生理盐水冲洗干净后放入4%甲醛固定液中保存，待HE 染色后于光镜下观察心肌组织形态学改变。留取部分左心室放入4%戊二醛固定，待电镜观察。

1.4 检查指标及方法

1.4.1 血浆肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平测定 酶联免疫吸附法（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）测定血浆中cTnⅠ、CK、TNF-α、IL-1β 水平，药盒购自北京欣博盛生物科技有限公司，具体操作步骤按照说明书进行。

1.4.2 苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）观察心脏组织形态学改变 心肌组织在4%多聚甲醛中室温固定48 h，石蜡包埋，切片，HE 染色，在光学显微镜下观察（DM3000 LED，Wetzlar，德国）。根据Kishimoto 方法[5]对每组小鼠心肌病理变化进行评分，即每张切片选取5 个高倍视野，从炎性细胞浸润和心肌变性坏死两方面观察病变情况，计算每个视野中炎性浸润和坏死区域面积与整个视野的面积之比，无病变计0 分，＜25%计1 分，25%～50%计2 分，50%～75%计3 分，＞75%计4 分。

1.4.3 透射电子显微镜观察心脏组织线粒体改变 取出经4%戊二醛固定的心脏组织，经脱水、包埋、切片及染色后，在电镜下（HT7800/HT7700，东京，日本）观察，采集不同倍数下心肌组织中线粒体形态及自噬小体图像并留存。

1.5 统计学处理 采用SPSS21.0 统计软件包，数据均以±s 表示，多个样本均数间比较采用单因素方差（ANOVA）分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠心脏功能指标变化 与Control 组相比，SMI 组小鼠心脏功能指标LVEF、LVFS 及CO 均明显降低（分别为65.96±8.16 vs.35.78±4.87，35.87±6.05 vs.16.80±2.58，18.19±2.84 vs.9.34±1.23，均P＜0.05）；与SMI 组相比，SMI+Levo 组LVEF、LVFS 及CO 差异有统计学意义，三者均明显升高（分别为35.78±4.87 vs.45.88±2.63，16.80±2.58 vs.24.01±3.4，9.34± 1.23 vs.14.80±3.41，均P＜0.05），见图1。

图1 入组后6 h 各组小鼠LVEF、LVFS、CO 水平变化Fig 1 Changes in LVEF，LVFS，and CO levels of mice in each group 6 hours after grouping

2.2 小鼠心肌损伤指标变化 与Control 组相比，SMI 组小鼠心肌损伤指标cTnI、CK 均明显升高（1.25±0.36 vs.6.99±0.39，866.93±378.51 vs.5 427.22±875.23，均P＜0.05）；与SMI 组相比，SMI+Levo 组小鼠cTnI、CK 均明显降低（分别为6.99±0.39 vs.6.24±0.46，5 427.22±875.23 vs.3 587.67±460.90，均P＜0.05），见图2。

图2 入组后6 h 各组小鼠血浆cTnI、CK 水平变化Fig 2 Changes in plasma cTnI and CK levels of mice in each group 6 hours after grouping

2.3 小鼠血浆炎症因子水平变化 与Control 组相比，SMI 组小鼠的血浆TNF-α（μg/L）、IL-1β（μg/L）水平均显著升高（58.33±10.98 vs.658.50±91.87，32.83±3.43 vs.114.83±5.98，均P＜0.01）；与SMI 组比较，SMI+Levo 组小鼠TNF-α、IL-1β 水平均明显降低（658.50±91.87 vs.431.00±18.17，114.83±5.98 vs.74.70±26.13，均P＜0.01），见图3。

图3 入组后6 h 各组小鼠血浆TNF-α、IL-1β 水平Fig 3 Plasma TNF-α and IL-1β levels of mice in each group 6 hours after grouping

2.4 小鼠心肌组织形态学变化 Control 组小鼠心肌组织形态结构正常；SMI 组小鼠出现心肌纤维排列不规整，部分心肌纤维断裂，横纹模糊甚至消失，间质出血水肿，炎性细胞浸润等改变；与SMI 组相比，SMI+Levo 组小鼠心肌损伤有所好转，见图4。与Control 组相比，SMI 组小鼠心肌组织病理评分明显升高（P＜0.05）；SMI +Levo 组与SMI 组相比，病理学评分虽无统计学差异，但有下降趋势，见图5。

图5 入组后6 h 各组小鼠心肌病理变化评分Fig 5 Score of myocardial pathological changes of mice in each group 6 hours after grouping

2.5 小鼠心肌组织线粒体形态改变 Control 组小鼠心肌细胞线粒体形态规整；SMI 组小鼠心肌细胞线粒体排列紊乱、水肿、线粒体嵴减少，偶见空泡变性，排列不整齐，肌丝束分离，Z 线扭曲，间距缩短，自噬小体增多；SMI+Levo 组与SMI 组相比，心肌组织线粒体损伤有所好转，见图6。

图6 入组后6 h 各组小鼠心肌组织线粒体形态改变Fig 6 Morphological changes of mitochondria in myocardial tissue of mice in each group 6 hours after grouping

3 讨论

脓毒症是临床上最为常见的急危重症，近年来其发病率逐年升高，已成为重症患者死亡的主要原因。据研究调查显示，每年约有脓毒症患者3 000 万例，死亡人数高达600 多万[6]。SMI 是脓毒症最严重和致命的并发症之一。

SMI 的作用机制目前尚在研究当中，据已有的研究证实，SMI 的作用机制包括：（1）促炎/抗炎反应失调[7]。（2）细胞凋亡[8]。（3）氧化应激[9]。（4）线粒体功能障碍[10]等。但确切机制尚未完全阐明。

研究表明，脓毒症或脓毒症休克患者可以发生左心室收缩功能障碍[11]。LVEF、LVFS 及CO 是反映心脏收缩功能较好的指标。在脓毒症发展过程中，多种原因会导致微循环毛细血管通透性改变，使血管容量减少[12]。SMI 时，心脏超声显示LVEF、LVFS及CO 显著下降。本实验研究结果也证明，SMI 组LVEF、LVFS 及CO 明显低于Control 组，提示腹腔注射LPS后，脓毒症小鼠存在左室收缩功能障碍。SMI+Levo 组与LPS 组相比，LVEF、LVFS 及CO 的升高具有统计学意义，提示Levo 可显著改善小鼠左室收缩功能。

cTnI、CK 是观察心肌损伤的重要生物标志物。cTnI 大部分以结合蛋白的形式固定在肌原纤维上，当心肌细胞受到损害时，游离状态的cTnI 会首先进入到细胞外液的血液循环中，浓度越高，反映心肌损伤越严重[13]。CK 主要存在于心肌细胞线粒体和胞质中，参与细胞能量转运、肌肉收缩及ATP 的再生[14]。近年来认为心肌线粒体膜肿胀、通透性增加、线粒体释放相关凋亡蛋白等是导致脓毒症心力衰竭的主要机制[15]，因此在SMI 小鼠中cTnI、CK 的水平明显升高。本实验结果进一步证实，在腹腔注射LPS 6 h 后，SMI 组小鼠cTnI、CK 水平明显升高，SMI+Levo 组相较于SMI 组，cTnI 与CK 水平明显下降。由此可见，Levo 可减轻SMI 小鼠的心肌损伤，机制可能为Levo 直接与cTnI 的氨基末端结合，增强cTnI 与钙离子复合物的构象稳定性和维持线粒体的稳定性[16-17]。

促炎/抗炎反应失调在脓毒症发展过程中也发挥了非常重要的作用。TNF-α 是首先被证实在脓毒症炎症瀑布中起重要作用的细胞因子[18]。TNF-α 与心肌细胞上的受体结合，影响心肌收缩时钙离子流动，出现心肌收缩功能障碍。IL-1β 在脓毒症感染模型中也常见升高，产生心肌抑制因子。此外，TNF-α与IL-1β 间存在正反馈，也可促进多种促炎细胞因子的产生[19]。本实验可见，SMI 组小鼠血浆TNF-α、IL-1β 水平显著升高，提示SMI 小鼠存在炎症反应失调。SMI+Levo 组与SMI 组相比，血浆TNF-α、IL-1β水平显著下降，证实Levo 有抗炎作用，可能通过抑制SMI 小鼠炎症级联反应进而减轻心肌损伤。从心肌组织形态学来看，SMI 组小鼠出现心肌纤维排列不规整，部分心肌纤维断裂，横纹模糊甚至消失，间质出血水肿，炎性细胞浸润等改变。SMI+Levo 组小鼠心肌组织病理评分有好转趋势，但无明显的统计学差异，可能与样本量较小有关。

脓毒症还可以引起线粒体损伤与功能障碍[20]。脓毒症会导致体液大量丢失，组织严重缺氧，刺激体内一氧化氮（NO）、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）过量生成，导致线粒体氧化应激水平升高，ATP 生成减少[21]，线粒体能量代谢障碍，功能异常。此外，LPS 也可诱导NO 合酶生成，使NO 过量产生。脓毒症患者外周血中的白细胞在抗炎过程中损伤线粒体内膜，线粒体氧化应激与内膜损伤互为正反馈，加速线粒体损伤[22]。在TNF-α 等细胞因子和氧化应激的共同作用下，线粒体内外钙离子稳态失衡，大量钙离子流入线粒体内，形成“钙超载”。钙超载使线粒体通透性转换孔（permeability transition pore，PTP）呈高通透、持续开放状态，线粒体肿胀、结构破坏[23]，加速线粒体氧化应激和能量代谢障碍[24]。此外，脓毒症导致线粒体损伤的机制还包括：（1）线粒体呼吸链及内膜损伤[25]。（2）线粒体DNA 损伤与突变[26]。（3）线粒体解耦联[27]。（4）线粒体分裂、融合及生物发生异常[28]。（5）线粒体自噬[29]等。本实验通过电镜观察心肌细胞线粒体形态发现：SMI 组小鼠线粒体排列紊乱，大量线粒体嵴减少、空泡变性，这是线粒体损伤的标志。SMI+Levo 组线粒体损伤明显减轻，证明Levo 可改善SMI 小鼠心肌细胞的线粒体损伤进而达到保护心脏功能的目的。

综上所述，SMI 的病理发展过程是损害心肌细胞与线粒体结构，进而影响心脏收缩功能。之前研究证实Levo 对心力衰竭患者的心功能有着明显的保护作用[30]。本结果再次证实，Levo 可以有效改善SMI小鼠的心功能，可能与通过抑制炎症减轻线粒体损伤有关。这将为改善SMI 患者治疗方案，延长患者的生存时间和生活质量提供有效依据。但是，本实验仍具有一定局限性，动物实验不能完全代替临床，需要更多随机对照实验或真实世界研究的证据支持。