神经介素U蛋白在人甲状腺乳头状癌中表达的意义及作用机制

高关清，郭丹，卢文亚，张萍，王芳，石科

（1.河南省第二人民医院耳鼻咽喉科，郑州 451191；2.河南医学高等专科学校生物化学与医学遗传学教研室，郑州 451191；3.河南省第二人民医院普外科，郑州 451191）

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，预后通常较好[1]。与其他类型的肿瘤类似，甲状腺乳头状癌的早期诊断对提高生存率很重要。目前多种生物标志物和不同疗法成功用于甲状腺乳头状癌的诊断和治疗[2-4]。然而，阐明甲状腺乳头状癌转移的分子机制对于开发新的甲状腺乳头状癌治疗方法至关重要。

神经介素U（neuromedin U，NMU）蛋白是人体内源神经调节肽家族的重要成员，能够通过激活人体中枢和外周组织的神经介素U 受体1（NMU receptor 1，NMUR），发挥多样而复杂的生理功能[5]。NMU 是参与人体胃肠道免疫调节的重要角色，已有大量研究证实了它与炎症发生以及先天淋巴细胞的活性调控息息相关[6]。NMU 激活NMUR 后通过调节中枢神经系统和外周胃肠道运动两条途径来实现对能量平衡的调节[7]。

研究显示，NMU 具有控制肿瘤进展的能力，并且有可能成为监控肿瘤发生与进展的标志物。NMU表达升高或降低与肿瘤细胞迁移、侵袭、糖代谢、上皮间充质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）、维持肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）表型等密切相关，进而影响肿瘤的免疫反应、药物敏感性和治疗效果等[8]。结直肠癌细胞分泌的NMU 能在表达NMUR2 受体的CRC 细胞中诱导侵袭性表型[9]。NMU 也是肺腺癌患者预后不良的生物标志物[10]。然而NMU 在甲状腺乳头状癌中的表达及对其潜在影响仍然未知。本研究主要探讨NMU 蛋白在人甲状腺乳头状癌组织中的表达及临床意义及对细胞增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 基因表达GEPIA 分析 在线软件GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=NMU）是基于基因表达数据和肿瘤基因组图谱RNA 序列而建立的程序，本研究采用GEPIA 检测甲状腺癌和正常甲状腺标本中NMU mRNA 水平，及其在不同类型肿瘤中的表达。NMU 在甲状腺癌中的表达在expression DIY（The Boxplot TAB）中显示，截断标准为log2FC>1 和P<0.01。

1.2 临床资料 收集2016 年3 月—2022 年3 月河南省第二人民医院71 例甲状腺乳头状癌患者手术切除的肿瘤及正常组织标本，分析其临床病理资料特征。全部病例均经过病理证实，术前未经化疗或放疗，且具有完整的病例资料。收集患者的一般临床资料，包括年龄、性别、肿瘤分期、淋巴结转移和腺内传播等。71 例甲状腺乳头状癌患者年龄43～65 岁，平均年龄（57.5±5.75）岁；男性14 例，女性57例；肿瘤分期低级别者29 例，高级别者42 例；淋巴结转移未转移者28 例，转移者48 例；多灶者33 例，单灶者38 例。

1.3 试剂 NMU 抗体为兔抗人单克隆抗体（ab2296335、abcam、Cambridge），β-肌动蛋白（βactin）抗体（1∶1 000 稀释，ab8226、abcam）。免疫组化稀释浓度为1∶100，免疫印迹稀释浓度为1∶1 000；免疫组化二步法检测试剂盒（PV-6001）、DAB 显色试剂盒（ZLI-9018）均购于北京中衫金桥生物技术有限公司；噻唑蓝（methylthiazoly tetrazolium，MTT）购自美国Sigma-Aldrich 公司。

1.4 方法及免疫组化染色结果的评分标准 甲状腺乳头状癌肿瘤及正常的组织进行福尔马林固定，并用石蜡全包埋，包埋后的蜡块标本行5 μm 切片及免疫组化染色，抗体1∶100 稀释。切片于75℃孵育30 min 后，二甲苯脱蜡及梯度乙醇水合。柠檬酸缓冲液孵育20 min 后5% BSA 于室温封闭30 min。封闭后NMU 抗体孵育2 h，二抗孵育1.5 h，通过DAB 法显色，随后苏木素染色。组化切片于蔡司显微镜下拍照。

评分标准：阳性细胞比例：阳性细胞数<20%为0 分；阳性细胞百分率为20%～50% 记1 分；肿瘤细胞阳性百分率为50%～70% 记2 分；肿瘤细胞阳性百分率＞70%则为3 分；同时对阳性着色细胞的染色强度进行评分：阴性表达记0 分，弱阳性表达记1 分，中等阳性2 分，强阳性记为3 分；最终计分结果为阳性细胞比例分数加染色强度分数，范围为0～6 分。0～2 分为NMU 低表达，3～6 分为NMU 高表达。

1.5 细胞培养及转染 甲状腺乳头状癌的细胞系TPC-1 和KTC-1 细胞购自美国模式菌种收集中心（ATCC）。shRNA 质粒购自Addgene。TPC-1 和KTC-1细胞均于含有10%胎牛血清（FBS，美国Gibco 公司）的RPMI-1640 培养基（美国Gibco 公司）中进行培养。细胞转染采用脂质体转染法进行。细胞实验分为对照组（转染对照shRNA 质粒）及NMU 下调组（转染NMU 的shRNA 质粒），实验所用质粒购自Charles River 公司，货号SH814099，序列如下：CCGC TCCTGCTGCTGCTGCTGCT。取2 mL 灭菌的EP 管加入质粒或Lipo2000 和1.5 mL Opti-MEM 培养基，室温孵育5 min。随后两者混合后孵育20 min，加入细胞培养基中，6 h 后换液，24 h 后进行功能实验。

1.6 蛋白质印迹法（Western blotting）实验 利用RIPA 细胞裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA 法测量蛋白浓度。加入蛋白酶抑制剂后，将总蛋白进行10%SDS-PAGE 电泳后，转膜至聚偏氟乙烯（PVDF）的膜上，5%脱脂奶粉进行室温固定2 h，室温条件下NMU 一抗（1∶1 000）孵育2 h，随后Tris-HCL 缓冲液（TBST）洗脱未结合抗体，共洗5 次，每次5 min；随后室温山羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育45 min，TBST洗脱未结合抗体，共洗5 次，每次5 min，加入ECL增强显影底物后在曝光仪中检测信号，所得信号使用Image J 8.0 软件进行分析。

1.7 实时定量荧光PCR 通过TRIzol 试剂提取HUVEC 细胞内总RNA，并进行两步法反转录，条件为42℃，1 h，所得cDNA 通过SYBR 荧光探针进行实时定量聚合酶链式反应（PCR），并使用β-actin 作为内参，检测相关mRNA 的表达水平。实验结果采用2×δCT 法进行定量。NMU 正向：5′-AGT TGT GGA ATG AGG CAT CC-3′，反向：5′-GGA TGC ACA ACT GAC GAC AC-3′；β-actin：正向5′- GCA CTC TTC CAG CCT TCC TT-3′，反向：5′- GTT GGC GTA CAG GTC TTT GC-3′。以2-△△CT公式计算出β-actin 和NMU 相对表达量。

1.8 MTT 实验 细胞铺于96 孔板中，进行质粒转染处理后于48 h 加入40 μL 的MTT 试剂，37℃培养箱孵育4 h，应用200 μL 的DMSO 震荡溶解，随后在570 nm 波长下使用多功能酶标仪检测其吸光度值。每组实验设3 个重复，统计结果。

1.9 集落形成实验 细胞进行质粒转染处理后48 h铺于6 孔板中，每孔约1 000 个细胞，37℃培养箱培养14 d，随后使用0.2%的结晶紫染色15 min，使用4%多聚甲醛室温固定20 min，流水缓慢冲洗，随后奥林巴斯荧光显微镜下观察拍照，使用Image J 8.0软件分析图片。

1.10 统计学处理 统计学处理采用Graphpad 8.0软件。符合正态分布的计量数据采用±s 表示。通过GPEIA 数据库分析NMU mRNA 在甲状腺乳头状癌组织中的表达。通过卡方检验比较临床病理特征与患者肿瘤组织NMU 表达的相关性，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析揭示NMU 的mRNA 在甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织中高表达且与患者预后相关 首先通过GPEIA 数据库分析NMUmRNA 水平在512 例人甲状腺乳头状癌组织及对应的337 例正常组织中的差异，发现在肿瘤组织中NMU mRNA呈显著高表达（图1A，P=0.006）。且生物信息学分析结果证实甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织NMU 的表达与患者无病生存率显著相关（图1B，P=0.021）。

图1 NMU 的mRNA 水平在甲状腺癌中显著增加并与患者不良预后显著相关Fig 1 mRNA levels of NMU are significantly increased in thyroid cancer and are significantly associated with poor prognosis in patients

2.2 NMU 蛋白在甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织中高表达并与患者临床病理特征显著相关 将肿瘤组织按NMU 的表达水平分为高表达组与低表达组，结果发现，相对于正常组织，NMU 蛋白在人甲状腺乳头状癌组织中呈显著高表达（图2）。

图2 NMU 在甲状腺乳头状癌中的表达水平Fig 2 The expression levels of NMU in thyroid papillary carcinoma

对染色结果进行评分量化分析，结果证实，NMU 表达水平与甲状腺乳头状癌患者的肿瘤分期（P=0.004）及多灶情况等（P=0.006）密切相关，而与其他的临床特征，包括年龄（P=0.461）、性别（P=0.422）、淋巴结转移（P=0.938）等无显著相关性（表1）。

表1 71 例甲状腺乳头状癌患者NMU 的表达水平与临床病理特征相关性分析[n（ %）]Tab 1 Correlation analysis between NMU expression levels and clinical pathological characteristics in 71 patients with papillary thyroid cancer[n（ %）]

2.3 下调NMU 蛋白抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖 与对照组相比，NMU 下调组TPC-1 和KTC-1细胞NMU 的mRNA 及蛋白水平均显著下降（t=7.96、7.37、10.42、7.69，均P＜0.05），见图3。

图3 NMU 的shRNA 在甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1 和KTC-1中的沉默效率Fig 3 shRNA silencing efficiency of NMU in thyroid papillary cancer cell lines TPC-1 and KTC-1

集落形成实验结果表明，在TPC-1 和KTC-1细胞中，NMU 蛋白的下调会导致形成集落的数量下降（图4A，t=12.43，P=0.001 1；t=16.46，P=0.000 5）。MTT 实验结果表明，在TPC-1 和KTC-1 细胞中，NMU 蛋白下调后TPC-1 和KTC-1 细胞平均吸光度值均下降（图4B，t=7.33，P=0.005 2；t=8.08，P=0.004 0）。

图4 NMU 下调抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖Fig 4 NMU down-regulation inhibited the proliferation of thyroid papillary cancer cells

3 讨论

甲状腺乳头状癌是最为常见的一种甲状腺癌，其生长缓慢，恶性程度低，预后通常较好。其发生会受到辐射、激素、遗传、环境及炎症等因素的影响。由于甲状腺乳头癌对放化疗不敏感，因此靶向治疗便成了最有潜力的一种治疗手段[11]。然而截至目前，甲状腺乳头状癌的治疗靶点有限。为了进一步提高患者的生存率，仍需发现新的更有效的治疗靶点。NMU 在多种肿瘤中均出现高表达并与不良预后相关，因此进一步借助ProteinAtlas 验证NMU mRNA在多种肿瘤中与患者预后的相关性。在本研究中发现，NMU 在甲状腺乳头状癌中显著高表达，并与患者的无病生存期显著相关，提示不良预后。进一步的临床病理特征分析证实NMU 的表达与患者的肿瘤分期及多灶情况密切相关，而这两种特征均与甲状腺乳头状癌的转移有关。因此推测NMU 可能参与甲状腺乳头状癌的进展和转移，是一个甲状腺乳头状癌的潜在治疗靶点和标志物。

为了证实推测，进一步利用两种甲状腺乳头状癌的细胞系开展体外实验。通过转染NMU 的shRNA 质粒，下调NMU 的表达，并通过集落形成实验和MTT 实验检测其对细胞增殖的影响，结果表明，NMU 的下调显著抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖。因此，研究初步揭示了NMU 在甲状腺癌中的功能。NMU 表达水平的改变能够影响癌细胞的多种功能，如增殖、迁移、侵袭、代谢、EMT 等，进而影响肿瘤免疫、药物敏感性和治疗效果[8]。研究表明，结直肠癌细胞分泌的NMU 能够调节肿瘤微环境，促进细胞侵袭[9]。另有研究证实，NMU 在人树突细胞中表达[12]，而NMUR1 在免疫效应细胞（如T 细胞、NK 细胞）中表达[13]，提示抗原提呈细胞和免疫效应细胞群之间存在相互作用，并进一步提示NMU 可参与肿瘤的免疫治疗。

除此之外，NMU 作为一种神经调节蛋白，也能参与代谢过程，负责调节能量消耗、进食行为，维持生命的新陈代谢[14]。而肿瘤的微环境及肿瘤细胞代谢在甲状腺癌进展与转移中同样扮演重要角色[15]，故有理由推测NMU 可能通过调控甲状腺肿瘤细胞的代谢影响肿瘤进展。在本研究中，初步发现NMU对甲状腺乳头状癌细胞增殖的影响，而对于细胞迁移及代谢等方面的影响仍需进一步体内外研究证实。

总之，本研究发现了NMU 在甲状腺乳头状癌中显著高表达，并与患者的无病生存期显著相关。NMU 的表达水平与甲状腺癌患者的肿瘤分期及多灶情况密切相关，且NMU 的下调能够抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖，提示其可作为甲状腺乳头状癌的潜在治疗靶点。