褪黑素联合盐酸米诺环素对牙周致病菌混合生物膜的抑制作用

杨雨晴，叶静，刘青，阙克华，张溪，刘颖

（1.天津医科大学口腔医院牙体牙髓科，天津 300070；2.天津市天津医院口腔科，天津 300211）

牙周炎是由于牙菌斑中的细菌侵犯牙周组织而引起的慢性炎症性疾病。临床中治疗牙周炎的关键是控制菌斑，常规治疗方法包括机械治疗和手术治疗。但是，由于口腔解剖结构的复杂性，牙周袋底、根分叉等区域器械难以到达，而菌斑微生物无法被彻底清除可导致牙周治疗失败[1]。因而，临床中会辅以药物治疗以提高菌斑生物膜的控制效果[2]。目前，临床上常用于牙周炎辅助治疗的药物有甲硝唑、阿莫西林、四环素等抗生素类药物，其中盐酸米诺环素（minocycline hydrochloride，MINO）是治疗牙周炎最常用的抗生素之一，对多种牙周病原体具有显著抑制作用，同时能抑制胶原酶和基质金属蛋白酶的活性，减少对牙周结缔组织和骨组织的破坏，有利于缓解牙周炎症[3]。但药物导致的细菌耐药问题仍无法避免，且单一用药仍不能获得理想的治疗效果[4]，需要探索更安全、高效的药物辅助治疗方案。

褪黑素（melatonin，MEL）是一种由色氨酸分子衍生的内源性物质，不仅具有抗炎、抗氧化等生理功能，而且研究发现其与环丙沙星、多黏菌素等药物联合应用时，具有提高药物疗效、降低最小抑菌浓度和降低药物毒性的能力[5]。近年来，褪黑素在口腔领域的研究也取得一定的进展，研究表明，褪黑素对浮游状态下的牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌具有明显抑制作用；还具有控制牙周组织的炎症，抑制局部牙槽骨吸收，促进牙周愈合的潜能[6-7]。然而，褪黑素与菌斑抑制药物联合应用对牙周炎的辅助治疗作用尚未见国内外文献报道。因此，本研究旨在探究褪黑素与盐酸米诺环素联合应用对牙周致病菌及其混合生物膜的抑制作用，为临床治疗牙周炎提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 戈登链球菌（Streptococcus gordonii，S.g，ATCC10558）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g，ATCC33277）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F.n，ATCC25586），伴放线聚集杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans，A.a，ATCC 43717）为天津医科大学口腔医学院实验室储存。

1.1.2 主要试剂和仪器 褪黑素（上海生工生物工程股份有限公司）、盐酸米诺环素（上海源叶生物科技有限公司）、脑心浸出液培养基（BHI 奥博星生物技术有限责任公司）、电热恒温培养箱（上海跃进HDPN-II-256 型）、高速离心机（美国Sigma）、酶标仪（美国ThermoFisherScientific），紫外分光光度计（美国BECKMAN），Axio-Imager_LSM-800 型激光共聚焦显微镜（CLSM 德国卡尔蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 药物配制 用无菌去离子水将盐酸米诺环素配置成浓度为1 mg/mL 的母液。将80 mg 褪黑素溶解于1 mL 二甲基亚砜（DMSO）中配置成8%的母液，溶剂DMSO 的终浓度为0.1%。上述溶液均经0.22 μm 滤网过滤消毒后储存于4℃备用。

1.2.2 实验菌种的复苏与培养 将S.g、F.n、P.g、A.a复苏后接种于BHI 固体培养基进行培养，F.n、P.g、A.a 置于厌氧（80% N2，20% CO2）环境、S.g 置于微需氧（5%O2、85%N2、10%CO2）环境下37℃培养，观察菌落形态并确认为纯培养后，挑单菌落于BHI 液体培养基中继续静置培养至对数生长期，3 000 r/min，5 min 离心后重悬菌液，配制成1×107CFU/mL 菌悬液保存备用。

1.2.3 牙本质片的制备 本研究经天津医科大学口腔医院医学伦理委员会批准（批准号：TMUhMEC20221107）。纳入标准：离体牙发育完全，牙体完整，无裂纹，无龋坏，无充填物。将存于0.1%麝香草酚中的离体磨牙制备成3 mm×3 mm×1 mm（长×宽×高）的牙本质片，使用砂纸打磨抛光，共制备50 片。随后将其置于17%EDTA 溶液中1 min，超声荡洗10 min。高温高压灭菌30 min 后，随机抽取2 片置于BHI 液体培养基中，37℃微需氧条件下静置培养24 h，以检测牙本质片表面灭菌效果。在确定无残余活细菌后，将牙本质片浸泡于无菌生理盐水中，4℃冰箱保存备用。

1.2.4 细菌间相互作用及混合菌悬液的制备 使用平板对峙法确定4 种细菌间是否具有相互作用，如无互相抑制作用则可将上述各菌液按照1∶1∶1∶1的比例混合，建立多菌种混合菌悬液模型，同样调整接种混合菌悬液浓度约为1×107CFU/mL。

1.2.5 测定盐酸米诺环素和褪黑素的MIC 和MBC 测定褪黑素的MIC 采用液体二倍稀释法，阴性对照组为含5% DMSO 的菌悬液和不含药物的菌悬液，每个浓度设3 个复孔，培养条件同1.2.2。按照同样方法将盐酸米诺环素溶液稀释，阴性对照组为不含药物的菌悬液，每个浓度设3 个平行孔。若肉眼观察孔内无细菌生长则对应的浓度即为MIC 值。采用菌落计数法测定各菌MBC 值：从所有大于或等于MIC 的实验组内取20 μL 菌液分别涂布于BHI 固体血平板上，S.g 于37℃下微需氧环境培养24 h，其余细菌均于厌氧37℃培养48 h 后分别进行菌落计数，肉眼观察培养基中无菌落生长的最低药物浓度即为MBC 值。实验于不同时间重复3 次。

1.2.6 褪黑素联合盐酸米诺环素抑菌浓度分数指数（FICI）的测定 采用微量棋盘稀释法，在无菌96 孔板中盐酸米诺环素从横排加入，褪黑素从纵排加入。盐酸米诺环素和褪黑素的终浓度均为2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、1/64MIC，盐酸米诺环素和褪黑素照浓度由高到低分别加入药液和菌悬液各100 μL，阴性对照组每孔均加入BHI液体培养基和菌悬液各100 μL，培养条件同1.2.2。实验于不同时间重复3 次。根据96 孔板中联合药敏抑菌情况与单独药敏抑菌情况计算FICI，计算公式如下：FICI=甲药联合时MIC/甲药单独时MIC+乙药联合时MIC/乙药单独时MIC。当FICI≤0.5 时联合药敏表现为协同作用，0.52 时为拮抗作用。

1.2.7 两药联合对牙周主要致病菌单菌种和混合生物膜形成的作用 在96 孔板中，每孔先加入100 μL S.g、F.n、P.g、A.a 和混合菌悬液，后实验组分别加入100 μL 药液（终浓度为1%的褪黑素联合2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 的盐酸米诺环素溶液），阳性对照组为单独盐酸米诺环素（终浓度为2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC），阴性对照组分为两组，不含药物的BHI 液体培养基和含5% DMSO 的溶液，每组3 个复孔，于相应培养环境下静置培养48 h。48 h 后移除培养基及悬浮细菌，PBS 冲洗，然后往孔板内加入戊二醛固定15 min，吸出干燥后每孔加200 μL 结晶紫溶液，染色20 min，去离子水冲洗，37℃恒温箱中烘干15 min，每孔加200 μL 95%乙醇溶液，静置5 min，酶标仪检测菌悬液在600 nm处的OD 值。生物膜抑制率=（阴性对照组OD600-实验组OD600）/阴性对照组OD600×100%[8]。

1.2.8 两药联合对牙周主要致病菌单菌种和混合生物膜的离散作用 96 孔板内建立48 h 单菌种和多菌种生物膜，48 h 后移除培养基及悬浮细菌，PBS冲洗。实验组分别加入100 μL 的药液（终浓度为1%的褪黑素联合2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的盐酸米诺环素溶液），阳性对照组为单独盐酸米诺环素（终浓度为2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC），阴性对照组分为两组，不含药物的BHI 液体培养基和含5% DMSO 的溶液，每组3 个复孔，继续培养48 h，结晶紫染色法检测各组生物膜在600 nm 处的OD 值。生物膜清除率=（阴性对照组OD600-实验组OD600）/阴性对照组OD600×100%。

1.2.9 CLSM 评估两药联合应用对混合生物膜的抑制及离散作用 对于生物膜形成的测定，将牙本质片分为3 组（n=8）置于48 孔板中，每孔加入200 μL混合菌悬浮液，实验组分别加入200 μL 终浓度为1%+1/4MIC 和1%+1/2MIC 的两药混合溶液，阳性对照组加入200 μL 终浓度为1/4MIC 和1/2MIC 的盐酸米诺环素溶液，阴性对照组加等量含氯化血红素-Vk 溶液的BHI 培养基，每组3 个复孔，在37℃、厌氧环境下静置培养48 h 后检测药物对多菌种生物膜形成的影响。

对于生物膜离散的测定，将牙本质片分为3 组（n=8）置于48 孔板中，每孔加入200 μL 混合菌悬浮液，37℃、厌氧环境下静置培养48 h，以建立48 h多菌种生物膜模型。实验组分别加入200 μL 终浓度为1%+1/2MIC 和1%+MIC 的两药混合溶液，阳性对照组加入200 μL 终浓度为1/2MIC 和MIC 的盐酸米诺环素溶液，阴性对照组加等量含氯化血红素-Vk 溶液的BHI 培养基，每组3 个复孔，于相应环境下静置培养24 h 后分别检测药物对多菌种生物膜离散的影响。

上述样本处理后，将每组的生物膜上清液吸除，处理后各组避光条件下加入SYTO-9/PI 混合液1 mL，用PBS 漂洗2 次，去除残液，使用CLSM 观察牙本质片表面多菌种生物膜的情况，每个样本均随机选取3 个视野进行观察。观察条件为SYTO-9 的激光发射波长为488/525 nm，PI 的激光发射波长为561/642 nm，并用Imaris v.7.2.3 图像分析软件确定红色荧光面积代表的死菌总量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 26.0 统计软件对本次研究的数据结果进行分析，正态分布的计量数据用±s 表示，采用单因素ANOVA 方差分析，两两比较应用LSD-t 检验方法，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 褪黑素和盐酸米诺环素对各致病菌的MIC 和MBC 褪 黑素 对S.g、F.n、P.g、A.a 的MIC 值 均 为1%，MBC 值均为2%，对混合菌液的MIC 值为2%，MBC 值为4%。盐酸米诺环素对S.g、F.n、P.g、A.a 和混 合 菌 液 的MIC 值 分 别 为4、4、8、8、16 μg/mL，MBC 值分别为32、32、64、64、128 μg/mL。

2.2 两药联用对各牙周致病菌及混合菌悬液的MIC 采用微量棋盘稀释法测得褪黑素和盐酸米诺环素联合用药实验的结果。在联合应用时对S.g 的MIC褪黑素=0.5%，MIC盐酸米诺环素=0.062 5 μg/mL，FICI=0.515 6>0.5，表明两者联合对S.g 的抑菌效果为相加作用。在联合应用时对F.n 的MIC褪黑素=0.5%，MIC盐酸米诺环素=0.062 5 μg/mL，FICI=0.515 6>0.5，表明两者联合对F.n 的抑菌效果为相加作用。二者联用时对P.g的MIC褪黑素=0.25%，MIC盐酸米诺环素=0.125 μg/mL，FICI=0.265 6≤0.5，表明两者对P.g 的抑菌效果为协同作用。二者联用时对A.a 的MIC褪黑素=0.25%，MIC盐酸米诺环素=0.125 μg/mL，FICI=0.265 6≤0.5，表明两者对A.a 的抑菌效果为协同作用。二者联用时对混合菌悬液的MIC褪黑素=1%，MIC盐酸米诺环素=0.25 μg/mL，FICI=0.515 6>0.5，则两者对混合菌悬液的抑菌效果为相加作用。

2.3 两药联合对牙周主要致病菌单菌种及混合生物膜形成的抑制作用 结晶紫染色法结果显示，两药联合处理组生物膜形成量随药物浓度的增加而逐渐降低，说明药物对生物膜形成的抑制作用呈现浓度依赖。除F.n 中1%+1/8MIC 和1%+1/4MIC 组，两药联合对单菌种和混合生物膜的生物膜生物量与单独盐酸米诺环素组相比显著降低（P<0.05）。结果还显示，当褪黑素和盐酸米诺环素联合作用时，对P.g、A.a 的抑制效果优于F.n 和S.g。

此外，当药物浓度为1%+1/2MIC 时，混合多菌种生物膜形成能力下降更为明显，抑制率可达55.3%，高于2MIC 盐酸米诺环素单独应用时的抑制率（19.0%），见图1。

图1 褪黑素联合盐酸米诺环素对各致病菌和混合生物膜形成的影响Fig 1 Effect of melatonin combined with minocycline hydrochlorid on biofilm formation in various pathogenic bacteria and mixed biofilms

2.4 两药联合对牙周主要致病菌单菌种及混合菌种生物膜的离散作用 结果表明，随着药物浓度的升高，两药联合使用对牙周主要致病菌单菌种和混合生物膜的离散作用也逐渐增强。除1%+1/8MIC组，其他各浓度组的生物膜量均明显低于非药物处理的对照组（P<0.05）。与单独盐酸米诺环素组相比，药物联合浓度≥1%+1/4MIC 时，S.g、F.n 和A.a 的OD 值均显著降低（P<0.05）。此外，两药联合应用对S.g、F.n 和A.a 生物膜的离散作用相当，而对P.g 的离散效果相对较差。结果还显示，当药物联合浓度为1%+MIC 时，相较于单独盐酸米诺环素，其对混合生物膜的清除率提高最显著，提高了20.2%，且清除效果高于单独使用时的2MIC 盐酸米诺环素，见图2。

图2 褪黑素联合盐酸米诺环素对各致病菌生物膜的离散作用Fig 2 Effect of melatonin combined with minocycline hydrochloride on the discrete of biofilms by various pathogenic bacteria and mixed biofilms

2.5 CLSM 观察两药联合对混合生物膜的抑制和离散作用 进一步应用荧光染色法评估褪黑素联合盐酸米诺环素对牙本质表面混合生物膜的抑制和离散作用（图3）。绿色荧光显示活菌，红色荧光为死菌。CLSM 可观察到，两药联合处理后的死菌数量较单独盐酸米诺环素组和Control 组显著增多。

图3 药物联合处理后对牙本质表面混合生物膜的CLSM 图像（ SYTO-9/PI staining，200×）Fig 3 CLSM images of mixed biofilm on the dentine surface after drug combination treatment（ SYTO-9/PI staining，200×）

3 讨论

菌斑生物膜是由多种微生物组成的生态系统，也是牙周炎的始动因子[9]。因此，生物膜的清理和控制是牙周炎治疗的主要目的。研究表明，药物治疗在牙周炎的治疗中具有抑制细菌、控制炎症、促进牙周组织再生的作用[10]，故药物治疗可以作为牙周基础治疗的辅助疗法以提高牙周炎治疗的成功率。但药物治疗可能存在诱导细菌耐药性等的潜在风险，因此，寻找一种更安全有效的牙周辅助治疗方式具有重要的临床意义。

本研究拟评估褪黑素与盐酸米诺环素联合应用对S.g、F.n、P.g、A.a 4 种细菌单菌种和混合多菌种浮游细菌和生物膜的抗菌性能。S.g 是菌斑生物膜的早期定植者之一[11]。F.n 通过表达多种黏附素发挥桥梁作用，连接早期和晚期定植菌以促进菌斑生物膜的形成和成熟[12]。P.g 是牙周炎病变区的优势菌，可参与生物膜的形成，释放多种毒力因子破坏宿主免疫细胞，引起牙周组织的破坏[13]。A.a 可分泌多种细胞毒素，从而加快牙周附着丧失和牙槽骨吸收[14]。这几种细菌均在牙周炎的发生、发展过程中起着重要作用。

盐酸米诺环素是临床牙周炎治疗的常用药物，但其长期应用可能导致抗生素耐药等问题，且单独使用达不到理想的治疗效果[15]。褪黑素是一种内源性吲哚类激素，具有很高的水溶性和脂溶性，近期研究发现在牙周炎患者中唾液褪黑素水平降低，提示褪黑素可作为牙周病诊断的重要生物标志物[16]，也有研究显示褪黑素对多重耐药、革兰阳性和革兰阴性细菌具有有效的抗菌活性[17]。Zhou 等[17]首次报道褪黑素对体外P.g 的作用，发现其对P.g 具有体外抗菌活性。本实验研究结果同样显示褪黑素对S.g、F.n、P.g、A.a 4 种细菌及混合菌悬液均有抑制作用。已有研究证实褪黑素与抗生素联合应用可提高抗生素的治疗效果，减少药物不良反应，故本实验探讨褪黑素与盐酸米诺环素联合应用对牙周致病菌的抗菌效果。联合药敏结果表明，两药联合使用将盐酸米诺环素的MIC 降低至单用时的1/64，同时，两药联用对P.g 和A.a 具有协同抑菌效果（FICI≤0.5），对S.g、F.n 和混合菌悬液表现为相加作用（0.5

口腔环境中的牙周致病菌主要是以混合生物膜形式存在，生物膜的耐药性较浮游细菌高100～1 000 倍[18]。为了更准确地评估褪黑素与盐酸米诺环素联合应用的抑菌性能，本研究结晶紫染色法以及CLSM 检测进一步评估了联合用药对4 种牙周致病菌混合生物膜形成和离散的影响。结果显示，联合用药对单菌种和混合生物膜均具有良好的抑制和离散作用，并呈现剂量依赖性。在抑制生物膜形成的实验中，当联合药物浓度为1%+1/2MIC 时，对混合多菌种生物膜抑制能力提升最为明显，生物膜抑制率从12.4%提高至55.3%，且相比于单独应用2MIC 的盐酸米诺环素抑菌能力增强36.3%。在生物膜离散实验中，两药联合浓度为1%+MIC 时，对混合生物膜的清除作用提升最为显著，清除率较单独应用盐酸米诺环素高20.2%，且清除效果显著高于单用2MIC 的盐酸米诺环素。本研究结果显示，混合生物膜与单菌种生物膜对药物的敏感性存在差异。因此，应用更加模拟临床的混合生物膜模型来评估药物的抗菌作用更为准确。CLSM 结果同样显示，两药联合处理后牙本质表面的死菌数量明显多于Control 组和单独盐酸米诺环素组。因此，本实验结果表明：褪黑素与盐酸米诺环素联合应用可显著提高单一用药对牙周致病菌生物膜的抗菌作用。此外，褪黑素还具有下调牙龈组织中促炎细胞因子的表达、抑制牙槽骨吸收、促进成骨细胞增殖的作用[19]。因而，褪黑素可能于控制牙周炎症和促进组织再生中发挥积极作用。

目前，药物联合应用的抗菌机制尚未明朗，分析其可能由于褪黑素可与细菌内的铁、铜和锌等金属离子螯合，降低细菌细胞内底物和细菌细胞膜表面的脂质水平导致细菌细胞膜通透性改变，使两种药物更容易进入细菌内发挥抗菌作用相关[6]。

综上所述，褪黑素联合盐酸米诺环素可显著提高对牙周致病菌斑生物膜的抑制和清除能力，并可降低盐酸米诺环素的药物浓度，预防细菌耐药性的发生，有望在牙周炎的辅助治疗中发挥作用。