黄芪建中汤对肝纤维化大鼠JAK/STAT信号通路的调节作用研究*

张学政 吴冬冰 张学娟 吴冬寒

三亚市人民医院消化内二病区 (海南 三亚,572100)

肝纤维化是由各种肝脏疾病引起的肝脏结缔组织异常增生的肝脏病理学变化,若不及时进行干预,肝纤维化会进展为肝硬化、肝癌等严重肝脏疾病及多组织器官并发症[1]。由于肝纤维化发病机制复杂且影响因素多,目前临床上用于治疗肝纤维化且疗效确切、安全性好的药物有限[2],所以对于抗肝纤维化药物的研发是亟需解决的问题。JAK/STAT信号通路是与炎症信号传递及细胞凋亡等生理活动相关的信号通路[3,4],研究发现肝纤维化的发生及进展与JAK/STAT信号通路表达异常密切相关[5,6]。黄芪建中汤是基于传统中医学理论的中药成方制剂,最早记载于中国古典医学著作《金匮要略》。现代医学研究发现黄芪建中汤对肝脏疾病具有治疗作用,且在临床应用中表现出显著疗效[7,8]。本文通过研究黄芪建中汤对肝纤维化大鼠的作用及机制,旨在为黄芪建中汤的药理作用研究及肝纤维化治疗药物的研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物 Sprague Dawley雄性大鼠60只,8周龄,体重200～220 g,购于海南医学院实验动物中心[许可证号:SCXK(琼)2018-0002],实验动物房温度24～26℃,湿度55%,光照12 h/d,自由饮食,单笼分组饲养,适应性喂养1周后进行实验。

1.2 药品及试剂 黄芪建中汤(黄芪、桂枝、生姜各9 g,白芍18 g,炙甘草6 g,大枣4枚和饴糖30 g)由药材饮片制成每毫升含18.4 g生药的制剂,购自北京同仁堂制药有限公司;秋水仙碱购自北京嘉林药业股份有限公司(国药准字:H20003842);HA(货号:CSB-EL010918RA)、PCⅢ(货号:CSB-E15810r)、LN(货号:EK0435)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒购自和序生物公司、ColⅣ酶(货号:KT-32025) ELISA检测试剂盒购自默瑞(上海)生物科技有限公司;RIPA蛋白裂解液(货号:P0013B)、RNA提取试剂盒(货号:R0016)、cDNA逆转录试剂盒(货号:D7168L)、SOD活性(WST-8法)检测试剂盒(货号:S0103),MDA检测试剂盒(货号:S0131M),p-JAK2(货号:AF1486)、p-STAT3(货号:AF1495)、JAK2(货号:AF1489)、STAT3(货号:AF1492)及GAPDH兔单克隆抗体(货号:AF1186),辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(货号:A0208)、化学发光试剂盒(货号:P0018M)、TNF-α (货号:PT516)、IL-1β(货号:PI303)、IL-6(货号:PI328)ELISA试剂盒购自碧云天生物科技有限公司;苏木素染液(货号:J28N6Y6648)、伊红染液(货号:Y13M6C2)均购自源叶生物科技有限公司。

1.3 主要仪器及设备 CKX53倒置显微镜(日本Olympus公司);1～16 k高速冷冻离心机(德国sigma公司);SpectraMax iD3多功能酶标仪(美谷分子仪器有限公司);GIS-500凝胶成像仪(杭州米欧仪器有限公司);DM2500光学/荧光显微镜(德国LEICA公司);Leica RM2245型石蜡切片机购自徕卡贸易有限公司;DYC456-8型电泳槽(北京六一仪器厂);HBS-1096C型酶标仪(南京德铁实验设备公司)。

1.4 肝纤维化大鼠建模及给药 大鼠按照15只/组随机分为对照组、模型组、黄芪建中汤组及阳性对照组,除对照组,其余各组参照文献[9,10]建立四氯化碳诱导(CCl4)的肝纤维化大鼠模型,具体方法为:每只大鼠按照3 ml/kg的剂量首次腹腔注射CCl4,之后按照3 ml/kg腹腔注射体积分数为50%的CCl4橄榄油溶液(橄榄油∶CCl4=1∶1),每周2次,连续给药8周后,随机抽取3只大鼠,以戊巴比妥溶液麻醉后断颈处死,迅速分离肝组织,采用苏木精-伊红染色法(HE染色)检查肝组织病理学变化,以评价造模是否成功,对照组大鼠腹腔注射给予等量橄榄油。未有大鼠在造模过程中死亡,45只造模大鼠中19只出现轻度腹水。黄芪建中汤组根据大鼠体重按照10 ml/kg的剂量灌胃给予大鼠黄芪建中汤(每毫升含18.4 g生药)[11],阳性对照组按照0.2 mg/kg灌胃给于大鼠秋水仙碱[10],1次/d,给药60 d[9]。

1.5 血清ALP、GGT、ALT、AST水平检测 大鼠眼眶取血至离心管中,4℃静置4 h后,4℃,3 500 rpm离心10 min,离心半径13.5 cm,取上清液,进样至全自动生化分析仪测定ALT、AST、ALP、GGT水平。

1.6 血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平测定 大鼠麻醉腹主动脉取血至离心管中,4℃静置4 h后,以4℃,3 500 rpm离心10 min,离心半径13.5 cm,取上清液,分别按照ELISA试剂盒说明书方法测定HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平。

1.7 肝组织MDA水平及SOD活性测定 取大鼠肝组织,置于组织匀浆器中研磨匀浆后,以12 000 rpm,4℃离心10 min,离心半径13.5 cm,按照试剂盒规定操作方法测定肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6及MDA水平及SOD活性。

1.8 肝组织病理学检查 取大鼠部分肝组织(6只/组),于中性甲醛中固定12 h后,置于石蜡包埋机中进行包埋,行5 μm切片,分别进行HE染色及Masson染色,显微镜下观察。

1.9 肝组织中JAK2、STAT3 m RNA水平测定 每组取6只大鼠。按照RNA提取试剂盒方法提取大鼠肝组织总RNA,并将总RNA逆转录成cDNA,荧光定量PCR检测肝组织JAK2及STAT3 m RNA的表达。用于检测实时定量PCR的各基因引物见表1,以β-actin为内参,2-ΔΔCt法计算表达量。

表1 各检测基因引物序列

1.10 肝组织JAK2、STAT3蛋白水平检测 取大鼠(6只/组)肝组织,使用裂解液裂解并进行组织匀浆,以4℃,12 000 rpm离心10 min,离心半径13.5 cm,取上清液,置于100℃水浴5 min变性。BCA法测定蛋白浓度后,取50 μg蛋白进行电泳分离,经转膜、封闭液封闭后,JAK2、STAT3及GAPDH抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜。磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜后,加入稀释(1∶2 000)后的山羊抗兔IgG室温条件下孵育2 h,PBST洗涤后,置于凝胶成像仪滴加适量发光液成像,使用Image J软件检测分析。

2 结果

2.1 大鼠血清ALP、GGT、ALT、AST水平 见表2。

表2 各组大鼠血清ALP、GGT、ALT、AST水平

2.2 大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平 见表3。

表3 各组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平

2.3 大鼠肝组织MDA水平及SOD活性水平 见表4。

表4 各组大鼠肝组织SOD活性及MDA水平

2.4 各组大鼠肝组织病理学检查 对照组大鼠肝组织无病理学改变;与对照组大鼠肝组织病理检查结果相比,模型组大鼠肝组织病理学提示细胞形状不规则,结构破坏,可见气泡样改变及大量炎性细胞浸润,肝组织纤维样改变,肝组织细胞坏死、脱落;与模型组比较,黄芪建中汤组及阳性对照组大鼠肝组织细胞组织病理学明显改善,肝细胞结构较完整,细胞坏死及炎性浸润明显减轻,纤维增生明显减轻。各组大鼠肝组织病理学检查结果见图1、2。

图1 各组大鼠肝组织病理学检查结果 (×200)

图2 大鼠肝组织Masson结果 (×200)

2.5 大鼠肝组织JAK2及STAT3 mRNA水平 见表5。

表5 各组大鼠肝组织JAK2及STAT3 mRNA水平

2.6 各组大鼠肝组织JAK2及STAT3蛋白水平比较 与对照组比较,模型组、黄芪建中汤组及阳性对照组肝组织JAK2、STAT3、p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,黄芪建中汤组及阳性对照组大鼠肝组织JAK2、STAT3、p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3水平显著降低(P<0.05);黄芪建中汤组p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3水平较阳性对照组显著降低(P<0.05);阳性对照组大鼠JAK2及STAT3蛋白水平与黄芪建中汤组不存在显著性差异(P>0.05)。各组大鼠肝组织JAK2及STAT3蛋白水平见图3及表6。

图3 各组大鼠肝组织JAK2及STAT3蛋白水平

表6 各组大鼠肝组织JAK2及STAT3蛋白水平

3 讨论

肝纤维化是指由病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性肝病等肝脏疾病所致的肝内结缔组织异常增生,如果致病因素长期不能去除,则会发展成肝硬化[1]。肝纤维化在临床表现上无显著特点,其进展为肝硬化等疾病过程中则常表现出疲乏无力、食欲减退、消化不良[12]。目前临床上用于治疗肝纤维化的药物有限,且存在有效率低等缺点,所以对于治疗肝纤维化药物的研发是目前的临床工作重点之一。

黄芪建中汤是由黄芪、桂枝、白芍、生姜等多种中药材组成的中药成方制剂,具有补脾益气,温阳散寒之功效,主要用于治疗用于气虚里寒,腹中拘急疼痛等疾病[13],广泛记载于中国古代医学著作中。现代研究表明,黄芪建中汤具有抗胃溃疡、抗肿瘤、抗疲劳及抗慢阻肺等多种药理作用[14-16]。张燕云等[7]报道了黄芪建中汤对病毒性肝炎具有一定的治疗作用;唐文哲等[8]研究发现黄芪建中汤对自身免疫性肝炎具有一定的改善作用;黄恒霞[17]报道了黄芪建中汤对肝郁脾虚症具有明显的改善作用。

JAK/STAT信号通路是多种细胞因子信号转导的共同途径,与细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等过程密切相关[18]。研究发现,JAK/STAT通路的异常激活能够促进炎症性疾病、淋巴瘤、白血病以及实体肿瘤等各种疾病的发生、发展[19]。孙玉霞等[20]发现慢性萎缩性胃炎模型大鼠的发病机制与JAK/STAT的异常激活有关,陈宇斐等[21]报道了JAK2/STAT3通路的异常激活能够诱导乳腺癌细胞的增殖和迁移。近年来有学者发现JAK/STAT通路的异常激活与肝纤维化的发病机制及疾病进展相关[22,23],其中,蒋亚玲等[22]报道了肝星状细胞纤维化病变与其JAK/STAT相关蛋白水平升高;李晋等[23]则发现川芎嗪能够改善小鼠肝纤维化症状,其机制与抑制JAK/STAT信号通路有关。

ALT、AST、ALP、GGT水平是反映肝功能的重要指标,其水平的升高提示肝细胞损伤坏死;PCⅢ是反映肝内Ⅲ型胶原合成的指标,与肝纤维化形成的活动程度密切相关;ColⅣ是肝纤维化过程中的早期标志之一,含量增高可较灵敏反映出肝纤维化过程;LN水平升高也能反映肝纤维化的进展,HA为基质成分之一,由间质细胞合成,其水平升高反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况,是肝纤维化和肝硬变的敏感指标[24]。肝组织SOD活性及MDA水平是反映肝组织细胞氧化应激损伤的重要指标,SOD活性降低及MDA水平升高则表明大鼠肝纤维化大鼠的肝组织氧化应激损伤加重[25]。本实验通过采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纤维化模型,研究黄芪建中汤对其的治疗作用及机制。结果表明,与模型组比较,黄芪建中汤组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平,大鼠肝组织MDA水平显著降低,肝组织SOD活性显著升高,提示黄芪建中汤能够明显改善肝纤维化大鼠的肝功能,抑制大鼠肝纤维化进展,改善大鼠肝组织细胞氧化应激损伤状态,促进大鼠肝组织细胞的恢复。同时,结果表明,黄芪建中汤组大鼠肝组织中JAK2及STAT3mRNA水平及JAK2、STAT3蛋白水平均显著降低,提示黄芪建中汤能够显著抑制JAK/STAT信号通路相关蛋白的异常表达,进而抑制JAK/STAT信号通路的过度激活,发挥其抗肝纤维化作用。黄芪建中汤组能够明显改善大鼠肝功能,降低肝纤维化大鼠肝纤维化水平及肝脏氧化应激损伤,其机制可能与调节JAK/STAT信号通路有关。