参芪益心方对ISO诱导的心肌细胞凋亡及内质网应激的影响

郭继芳，温以杰，吴道健，李作武

参芪益心方对ISO诱导的心肌细胞凋亡及内质网应激的影响

郭继芳1，温以杰2，吴道健3，李作武4

1.牡丹江医学院附属红旗医院心血管内二科，黑龙江牡丹江 157011；2.牡丹江医学院生理学教研室，黑龙江牡丹江 157011；3.浙江省人民医院毕节医院心内科，贵州毕节 551700；4.牡丹江医学院附属红旗医院感染二科，黑龙江牡丹江 157011

探讨参芪益心方对异丙肾上腺素（isoprenaline，ISO）诱导的心肌细胞凋亡及内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的干预效果。40只SD大鼠随机分为5组，即对照组（Con组）、模型组（ISO组）、曲美他嗪治疗组（QM组）、参芪益心方低剂量治疗组（SL组）、参芪益心方高剂量治疗组（SH组），每组各8只。除Con组外，其余各组大鼠皮下注射ISO诱导心肌损伤，Con组大鼠给予等量生理盐水，共4周；第3周开始QM组给予曲美他嗪混悬液5mg/（kg·d），SL组给予参芪益心方水煎剂10g/（kg·d），SH组给予参芪益心方水煎剂20g/（kg·d），Con组和ISO组给予等量生理盐水灌胃。实验4周末比较各组大鼠的心电图、超声心动图指标，心肌组织病理切片，肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、X盒结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）、cleaved caspase-3、p53正向凋亡调控因子（p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA）水平。与Con组比较，ISO组大鼠心电图出现异常Q波，ST段抬高，心率增快（<0.05），左室射血分数、左心室短轴缩短率明显降低，心功能下降（<0.05）；SL组和SH组较ISO组心功能改善（<0.05）。ISO组心肌结构紊乱，纤维化程度明显增强，可见纤维断裂与空泡样变性；SL组和SH组较ISO组纤维化程度降低，心肌纤维断裂和空泡减少。ISO组大鼠心肌组织的IRE1、XBP1、cleaved caspase-3、PUMA蛋白水平均显著高于Con组（<0.001）；SH组和SL组大鼠心肌组织的IRE1、XBP1、cleaved caspase-3、PUMA蛋白水平均显著低于ISO组（<0.05），且SH组降低较SL组更显著。ERS参与ISO诱导的心肌损伤，参芪益心方可降低IRE1、XBP1、cleaved caspase-3、PUMA水平，改善心肌损伤，且高剂量效果更显著。

参芪益心方；心肌损伤；内质网应激

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是细胞在机体受到外界刺激时引起的一种应激响应机制，强烈或持续的刺激激活凋亡信号通路，引起细胞凋亡[1-2]。抑制ERS可有效保护心肌，是防治心血管疾病的靶点之一[3]。本研究应用异丙肾上腺素（isoprenaline，ISO）诱导SD大鼠心肌损伤，给予参芪益心方治疗，检测内质网信号分子的变化情况，观测参芪益心方对心肌损伤的保护与抑制ERS的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠40只，雄性，6～8周龄，SPF级，购于哈尔滨医科大学实验动物学部[许可证号：SCXK（黑）2019-001，批次NO．230729211100021921]，体质量（200±20）g。饲养于牡丹江医学院医药研究中心动物饲养室（室温22℃，湿度60%）。动物实验设施使用许可号：SYXK（黑）2019-003。本实验经牡丹江医学院实验动物福利与伦理委员会批准（伦理审批号：20210901-10）。

1.2 药物及试剂

参芪益心方（人参20g，黄芪20g，仙鹤草30g，淫羊藿20g，茯苓20g，白术15g，丹参15g，桂枝10g，葶苈子15g，益母草15g，甘草10g，安徽药知源中药饮片有限公司，浓煎至含生药5g/ml），盐酸异丙肾上腺素（上海源叶生物科技有限公司），盐酸曲美他嗪片[施维雅（天津）制药有限公司]，苏木素（北京索莱宝生物科技有限公司)，伊红（安徽雷根生物技术有限公司），RIPA裂解液，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE凝胶配制Kit，QuickBlock™ Western溶液套装，ECL化学发光显色底物试剂盒（碧云天生物技术有限公司），Page Ruler Prestain Protein Ladder彩色预染蛋白质分子量标准（Thermo Scientific公司），β-Actin Rabbit Monoclonal Antibody、IRE1 Antibody、XBP1 Antibody、Cleaved- Caspase 3 Antibody（Affinity Biosciences），PUMA Polycional Antibody（武汉三鹰生物技术有限公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（碧云天生物技术有限公司）。

1.3 仪器

脱水机、包埋机、切片机（德国莱卡公司），RM6240多通道生理记录仪（成都仪器厂），电泳仪、转膜仪（BIO-RAD公司），佳能东芝Aplio i700超声仪（日本佳能），恒温水浴锅（上海蓝伊科学仪器厂），低温高速离心机（Eppeadorf公司），超微量核酸蛋白测定仪（型号：NanoDrop one，Thermo Fisher Scientific公司），化学发光成像系统（GE公司）。

1.4 方法

1.4.1 模型建立 SD大鼠适应性饲养1周，随机取8只为对照组（Con组），其余（32只）为实验组，给予颈背部皮下注射ISO建模，诱导心肌损伤，剂量2mg/（kg·d），Con组皮下注射等量生理盐水，连续2周。

1.4.2 分组与给药 实验2周后对大鼠进行心电图及超声心动图检查，确定造模成功。曲美他嗪能够优化心肌氧代谢，具有较好的抗心绞痛和心肌保护作用，故本研究选用曲美他嗪作为对照。将实验组随机分为四组：模型组（ISO组）、曲美他嗪治疗组（QM组）、参芪益心方低剂量治疗组（SL组）、参芪益心方高剂量治疗组（SH组），每组各8只；早上继续皮下注射ISO，Con组给予等量生理盐水；每晚各组分别给予灌胃一次：QM组给予曲美他嗪混悬液5mg/（kg·d），SL组给予参芪益心方水煎剂10g/（kg·d），SH组给予参芪益心方水煎剂20g/（kg·d），Con组和ISO组给予等量生理盐水，连续2周。

1.4.3 心电图检查 SD大鼠实验2周末和4周末，应用RM6240多道生理信号采集处理系统描记心电图。

1.4.4 超声心动图检测 SD大鼠于实验2周末和4周末行超声心动图检查。大鼠吸入麻醉后，取仰卧位，胸前心前区至剑突备皮，采用佳能东芝Aplio i700超声仪，探头频率14MHz，与胸骨成20°～30°夹角，显示沿二尖瓣瓣口至心尖方向的心脏左室长轴切面，测定左室前壁舒张末厚度（Dist A）、舒张末心室内径（Dist B）、左室后壁舒张末厚度（Dist C）、收缩期心室内径（Dist D），应用Teichholtz公式计算左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。

1.4.5 心肌组织病理学检查 选取大鼠心尖部组织置于4%多聚甲醛中固定48h，制备病理切片，苏木精–伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）和Masson染色光学显微镜观察；应用图像分析软件Image J计算胶原容积分数，即胶原容积分数（%）=胶原面积/组织面积。

1.4.6 蛋白质印迹法 检测心肌组织肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、X盒结合蛋白1（X-box binding protein1，XBP1）、cleaved caspase-3、p53正向凋亡调控因子（p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA）水平。取–80℃冻存心尖部组织20mg提取总蛋白，超微量核酸蛋白测定仪测浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，QuickBlock™ Western封闭振荡1h，加入一抗（1∶1000稀释），4℃冰箱摇床孵育过夜，洗膜3次，加入二抗（1∶1000稀释），震荡孵育1h，洗膜3次，ECL发光试剂显影，曝光，软件Image J对蛋白条带行灰度值半定量分析，结果用目的蛋白/β-actin比值表示。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 心电图变化

实验2周末大鼠心电图显示，与Con组比较，实验组记录Q波，ST段轻度抬高，心率明显增快[（426.33±22.27）次/min（332.26±17.35）次/min，<0.05]，见图1。实验4周末，与Con组比较，ISO组出现异常Q波，ST段抬高，心率增快（<0.05）；QM组记录Q波，室性早搏，SL组ST段上斜型抬高；与ISO组比较，SH组心率明显降低，ST段轻度上移，见图2。

图1 实验2周末大鼠心电图

图2 实验4周末大鼠心电图

2.2 超声心动图检测

实验2周末，与Con组比较，实验组大鼠心室前后壁心肌肥厚，心室腔内径缩小，心功能降低，造模成功，见图3，表1。实验4周末，与Con组比较，ISO组大鼠Dist A、Dist C减小，Dist B、Dist D增加，LVEF、LVFS明显减低（<0.05）。与ISO组比较，QM组、SL组、SH组大鼠在药物干预后各项指标均有改善，且SH组优于SL组，见图4，表2。

图3 实验2周末大鼠超声心动图

表1 实验2周末大鼠超声心动图指标变化（）

图4 实验4周末大鼠超声心动图

表2 实验4周末各组大鼠超声心动图指标变化（）

注：与Con组比较，*<0.05；与ISO组比较，#<0.05

2.3 心肌组织病理学变化

HE染色显示，Con组大鼠心肌细胞结构清晰，染色均匀，细胞间质无充血水肿，心肌纤维呈束状规则排列。而ISO组大鼠细胞肥大、结构紊乱，胞核不规则，可见核聚集，细胞间质血管充血扩张，炎细胞浸润，成纤维细胞明显增生，心肌纤维疏松肿胀，排列紊乱，可见肌纤维断裂与空泡样变性坏死。与ISO组相比，QM组大鼠心肌细胞间质充血扩张，少量炎症细胞浸润，心肌纤维轻度肿胀；参芪益心方治疗组大鼠心肌纤维排列相对规则，断裂与空泡变性减少，且SH组优于SL组，见图5。

Masson染色结果显示，与Con组相比，ISO组大鼠心肌组织蓝色胶原纤维明显增多，纤维化程度增强，胶原容积分数明显增高（<0.001）。SL组、SH组大鼠心肌组织的蓝色胶原纤维明显减少，心肌纤维化程度减轻，SH组较SL组明显（<0.05），见图6、图7。

图5 各组大鼠心肌组织HE染色（×200）

图6 各组大鼠心肌组织Masson染色（×200）

图7 各组大鼠的胶原容积分数比较

注：与Con组比较，*<0.001；与ISO组比较，#<0.05

2.4 蛋白质印迹法检测结果

ISO组大鼠心肌组织的IRE1、XBP1、cleaved caspase-3、PUMA蛋白水平显著高于Con组（<0.001）；SH组和SL组大鼠心肌组织的IRE1、XBP1、cleaved caspase-3、PUMA蛋白水平显著低于ISO组（<0.05），且SH组降低较SL组更显著，见图8。

3 讨论

ERS是细胞在受到应激刺激后，引起未折叠或错误折叠蛋白质不能被有效清除，导致这些蛋白质在内质网腔异常蓄积。ERS发生后，内质网上调分子伴侣表达水平，启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），促进错误折叠及未折叠蛋白质的降解，从而缓解ERS[4]。强烈或持续的刺激最终引起细胞凋亡。

IRE1是ERS的重要调节因子，在UPR和细胞凋亡中发挥关键作用[5]。当内质网受到应激，激活IRE1上的核糖核酸酶域，通过内质网降解减少未折叠或错误折叠蛋白在内质网内的蓄积[6-7]。凋亡蛋白酶（caspases）是促细胞凋亡的蛋白酶，处于细胞凋亡的核心地位[8-10]。XBP1能够与X盒顺式作用元件相结合，是调控ERS反应的关键信号因子。caspase-3通过级联反应诱发细胞凋亡，caspase-3可水解细胞核骨架，使DNA降解、核固缩、细胞凋亡[11-12]。caspase-3是最关键的细胞凋亡执行者，其活化形式cleaved caspase-3更有效评估凋亡程度。PUMA是Bcl-2家族中BH3-only亚家族成员，是p53促凋亡途径的必需因子。安琪等[13]发现丹参能降低GRP94、IRE1、p-JNK、caspase-12、cleaved caspase-3水平，改善ISO诱导的心肌损伤。本研究中ISO组的IRE1、XBP1、cleaved caspase-3、PUMA表达水平增加，表明ERS参与心肌损伤。

图8 各组大鼠IRE1、XBP1、cleaved caspase-3、PUMA蛋白水平比较

A.IRE1、XBP1、cleaved caspase-3、PUMA蛋白条带图；B.IRE1蛋白水平比较；C.XBP1蛋白水平比较；D.cleaved caspase-3蛋白水平比较；E.PUMA蛋白水平比较

注：与Con组比较，*<0.001；与ISO组比较，#<0.05

中医学认为心力衰竭的基本病机为心气（阳）虚、瘀血水饮停阻，气虚无以行血，血不利则为水，气不足则阳气衰，阳衰则水无以为输。参芪益心方中人参、黄芪补益心气，为君药；桂枝、淫羊藿温阳纳气，为臣药；丹参、益母草活血化瘀，茯苓、葶苈子、白术、仙鹤草利水渗湿，共为佐药；甘草补益中气，调和诸药，为使药，全方共奏益气温阳、活血利水之疗效。本课题组前期发现参芪益心方可影响心肌能量代谢[14-17]，改善心功能[18-19]，减少细胞炎症因子渗出，减轻炎症反应[20]。本实验亦表明参芪益心方对ISO诱导的心肌损伤具有保护作用。

综上，ERS参与ISO诱导的心肌损伤，参芪益心方可抑制IRE1、XBP1、cleaved caspase-3、PUMA表达，高剂量组的心肌保护作用更明显。

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Effects of Shenqi Yixin formula on isoprenaline induced cardiomyocyte apoptosis and endoplasmic reticulum stress

GUO Jifang, WEN Yijie, WU Daojian, LI Zuowu

1.Department of Cardiovascular Internal MedicineⅡ, Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang, China; 2.Department of Pathophysiology, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang, China; 3.Department of Cardiovascular Internal Medicine, Zhejiang Provincial People’s Hospital Bijie Hospital, Bijie 551700, Guizhou, China; 4.Department of Infection Medicine Ⅱ, Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang, China

To explore the effect of Shenqi Yixin formula on the isoproterenol (ISO) induced cardiomyocyte apoptosis and endoplasmic reticulum stress (ERS).40 SD rats were randomly divided into five groups: control group (Con group), model group (ISO group), trimetazidine group (QM group), low-dose treatment group of Shenqi Yixin formula (SL group) and high-dose treatment group of Shenqi Yixin formula (SH group), each group had 8 rats. Myocardial injury was induced by subcutaneous ISO injection in all groups except Con group, and the rats in Con group were given the same amount of normal saline for a total of 4 weeks. Starting from the third week, trimetazidine suspension was given 5mg/(kg·d) in QM group, Shenqi Yixin formula was given 10g/(kg·d) in SL group, Shenqi Yixin formula was given 20g/(kg·d) in SH group, Con group and ISO group were given the same amount of normal saline by intragastric administration. At the end of experiment 4 weeks, electrocardiograph and echocardiogram indexes, myocardial histological sections, inositol-requiring enzyme 1 (IRE1), X-box binding protein 1 (XBP1), cleaved caspase-3, and p53 upregulated modulator of apoptosis (PUMA) levels were compared among the groups.Compared with Con group, the rats in ISO group showed abnormal Q wave, ST segment elevation and increased heart rate (<0.05), left ventricular ejection fraction, left ventricular fractional shortening significantly decreased, and cardiac function decreased (<0.05). The cardiac function of the SL group and SH group were better than those of ISO group (<0.05). In ISO group, the myocardial structure was disordered, the degree of fibrosis was significantly enhanced, and fiber breakage and vacuole-like degeneration could be seen. The degree of fibrosis in SL group and SH group were lower than those in ISO group, myocardial fiber breakage and vacuolation decreased. The protein levels of IRE1, XBP1, cleaved caspase-3 and PUMA in myocardial tissue of rats in ISO group were significantly higher than those in Con group (<0.001). The protein levels of IRE1, XBP1, cleaved caspase-3 and PUMA in SH and SL groups were significantly lower than those in ISO group (<0.05), and the reduction in SH group was more significant than that in SL group.ERS was involved in ISO-induced myocardial injury. Shenqi Yixin formula reduced IRE1, XBP1, cleaved caspase-3, PUMA levels, and improved myocardial injury, and the effect was more significant at high doses.

Shenqi Yixin formula; Myocardial injury; Endoplasmic reticulum stress

R541

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.25.022

黑龙江省省属高等学校基本科研项目（2021-KYYWF-0512）

李作武，电子信箱：13946361218@126.com

（2022–09–28）

（2023–08–26）