加入尿激酶的改良血栓弹力图用于脓毒症纤溶状态评价

雷泽恺,白劲松,唐宁(.华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科,武汉430030;.成都市新都区中医医院检验科,成都60500)

脓毒症患者常出现以低纤溶状态为主要特征的凝血异常[1]。轻度低纤溶有助于将感染灶局限在局部[1]。然而,系统性的、过度的低纤溶状态也可能导致严重的凝血障碍,如脓毒症所致凝血病(sepsis-induced coagulopathy,SIC)或弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC),进而影响患者预后[2]。及时准确地评估脓毒症患者的纤溶状态,有助于指导临床治疗方案,改善患者结局。目前用于评价纤溶状态的常规临床指标包括D-二聚体(D-Dimer,DD)、纤溶酶-纤溶酶抑制物复合体(plasmin antiplasmin complex,PIC)及血栓弹力图(Thromboelastogram,TEG)参数[1]。DD为凝血激活和继发纤溶亢进的共同标志物,其变化不能特异反映纤溶状态;PIC是评价纤溶亢进的特异性指标,但其评估纤溶抑制的可靠性还需进一步验证;TEG通过持续检测37 ℃下全血标本的凝血全过程,可以动态观察反映内源凝血因子、纤维蛋白原、血小板及纤溶因子水平的一系列参数,快速评估凝血状态[2]。

血凝块最大振幅MA值后的30 min振幅占MA值的百分比LY30,反映了血凝块的溶解程度,健康人LY30参考区间为0%～7.5%。常规TEG对纤溶状态变化的敏感性较低,难以区分正常和低纤溶状态[3-4]。尿激酶(urokinase,UK)可激活纤溶酶原生成纤溶酶,促进纤维蛋白凝块溶解。向TEG试剂中加入UK,可获得正常样本更高的LY30值,提高TEG发现低纤溶的敏感性。既往研究采用加入UK的改良TEG(UK-TEG)评估脓毒症患者,发现UK-TEG的LY30与细胞损伤指标(乳酸、乳酸脱氢酶和胆红素)及患者死亡率相关[4]。本研究拟应用UK-TEG识别SIC和DIC,并与DD、PIC等纤溶指标比较,评估其在脓毒症中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 连续纳入2022年3月至6月入住同济医院重症医学科、符合sepsis 3.0定义[5]的临床诊断为脓毒症患者。根据国际血栓与止血学会(ISTH)推荐的评分系统(表1)[6-7],将纳入的脓毒症患者分为非脓毒症诱导凝血病(非SIC)组、SIC组和DIC组。SIC评分包含了序贯器官衰竭评估(SOFA),用于描述多器官功能损害程度[8]。排除标准包括:合并可显著影响纤溶功能的疾病或创伤史;已应用溶栓或抗纤溶药物;入院24 h内死亡或出院。另选择体检健康者作为健康人对照组。最终纳入脓毒症患者77例,分为非SIC组27例、SIC组21例、DIC组29例;健康人对照组40例。本研究经同济医学院伦理委员会批准(批准文号:2022伦审字S025号)。

表1 ISTH推荐的SIC与DIC评分系统

1.2标本采集与处理 收集入组研究对象及体检健康者入院24 h内的枸橼酸钠抗凝全血3.0 mL,用于UK-TEG检测。UK-TEG检测后的剩余全血2 000×g离心10 min,收集血浆检测DD、PIC等纤溶指标及凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fib)、血小板计数(PLT)等常规凝血指标,用于DIC和SIC评分。

1.3主要仪器与试剂 UK-TEG检测采用TEG5000分析仪(美国血液技术公司)及配套试剂,加入注射用UK(南大药业公司);DD及凝血常规指标检测采用STA-R MAX血凝仪(法国STAGO公司)及配套试剂;PIC检测采用HISCL5000化学发光仪(日本SYSMEX公司)及配套试剂。所有试剂均按照说明书要求配置、分装和保存。

1.4UK-TEG检测 用5 mL生理盐水溶解注射用尿激酶,制备1×105U尿激酶储备液,取4 μL尿激酶储备液加入TEG高岭土试剂管中,再加入1 mL待测,全血混匀,最终尿激酶浓度为80 U/mL。然后从试剂管中吸取340 μL标本加入TEG反应杯,再加入20 μL氯化钙,最后按照高岭土TEG操作流程,在TEG5000分析仪上完成检测。

1.5UK-TEG性能评价 (1)批内精密度:选取健康人和脓毒症患者血浆各10份,混合后每水平检测10次UK-TEG。(2)批间精密度:选取正常和异常TEG质控品各1份,连续10 d检测UK-TEG。(3)参考区间:选取40份健康人样本检测UK-TEG,以中位数的95%置信区间确定LY30参考区间上下限。

2 结果

2.1UK-TEG LY30的95%参考区间 基于40例健康人初步建立的UK-TEG LY30的参考区间为36.8%～85.9%。

2.2UK-TEG LY30检测的重复性 UK-TEG LY30的两水平批内及批间不精密度见表2,均低于本室LY30参数的允许不精密度15%。

表2 UK-TEG LY30的不精密度评价结果

2.3脓毒症患者与健康人对照者间基本信息及凝血参数比较 脓毒症患者28 d死亡率为24.7%(19/77),与健康人对照组相比年龄显著更高,而性别比差异无统计学意义(P>0.05)。3组及健康人对照组间各参数比较见表3。

表3 脓毒症患者与健康人对照者间基本信息及凝血参数比较

图1展示并比较了3组脓毒症患者组及健康人对照组间纤溶参数的结果,DIC组的UK-TEG LY30分别低于其他各组;DIC组的DD高于SIC组,而与非SIC组差异无统计学意义;脓毒症患者组PIC高于健康人对照组,但DIC、SIC与非SIC三组间差异均无统计学意义。

注:a,两组间比较,P<0.05;b,健康人对照组与其他各组比较差异均有统计学意义。

2.4UK-TEG LY30判断脓毒症的ROC曲线 根据ROC曲线,AUCROC为0.979(95%CI:0.952～1.000)。UK-TEG LY30判断脓毒症的最适阈值为43.5%,敏感性与特异性分别为96.6%和97.4%。

2.5纤溶参数与患者死亡的相关性 77例脓毒症患者中19例在入院28 d内死亡,利用多元Logistic回归分析各纤溶参数与患者死亡的相关性(见表4),纤溶参数异常分别定义为UK-TEG LY30=0%和PIC超出生物参考区间上限(0.8 μg/mL),由于几乎所有脓毒症患者DD均超出生物参考区间上限,未对DD给予赋值分类。结果这些参数中仅“UK-TEG LY30=0%”与脓毒症患者死亡独立相关。

表4 各参数与脓毒症患者死亡的相关性

3 讨论

由于组织因子在炎症细胞表面高表达、内皮细胞受损等,脓毒症患者存在凝血激活和纤溶抑制状态[9]。一方面,受损内皮细胞产生大量PAI-1;另一方面,凝血酶也可升高TAFI水平。这种纤溶抑制趋势可能有助于限制病原体局部扩散,但过度或持续的纤溶抑制也可导致微循环障碍、组织氧合能力下降等[2]。研究表明PAI-1和TAFI与脓毒症患者死亡风险相关,抗凝治疗可能有益。但是这些特异性生物学标志物检测需专门设备和试剂,临床应用受限。目前尚缺乏能反映纤溶抑制的常规指标。

DD作为凝血激活和继发纤溶亢进的标志物,其水平不仅与凝血酶和纤维蛋白生成相关,还受PAI-1抑制,因此反映纤溶抑制的特异性有限[10]。PIC和TEG的LY30指标虽可反映纤溶亢进,但难以识别纤溶抑制。基于前人研究[4],本研究建立了加入UK的改良TEG,提高LY30检出纤溶抑制的敏感性,并比较其与DD、PIC等在识别脓毒症凝血异常和预测预后方面的应用价值。结果显示,UK-TEG LY30=0%是这些纤溶指标中唯一与28 d死亡独立相关的一项。这与前期研究结果一致[4]。

ISTH推荐SIC评分可早期识别脓毒症凝血异常,SIC患者抗凝治疗往往获益[8,11-12]。本研究中,DIC组DD水平高于SIC组,可能误认为DIC患者继发纤溶亢进更显著,导致错误治疗。而DIC组UK-TEG LY30显著低于其他两组,准确反映DIC患者纤溶抑制更严重。SIC组LY30也较非SIC组降低,提示脓毒症发展过程中纤溶抑制持续加重。基于UK-TEG LY30的识别能力,未来可开展针对其结果给予抗凝干预的临床试验,探讨是否可改善预后。除预测效力优于其他指标,UK-TEG的优势还在于:TEG已广泛应用于临床,UK-TEG可快速床旁检测;UK易获得且廉价。本研究局限包括:样本量有限,需扩大样本量验证;UK-TEG检测步骤有待标准化;未全面评估临床结局的所有影响因素。

总之,本研究建立适用于中国人群的改良TEG评估脓毒症纤溶状态的方法,证实UK-TEG LY30识别凝血异常和预测死亡风险的能力,为后续干预研究奠定基础。