丁桂散脐部给药的体内药动学研究

张永太，李佳璇，姜晓炜，冯年平

（上海中医药大学 中药学院，上海 201203）

脐，中医穴位称之“神阙”，与人体十二经脉相连，与五脏六腑相通。脐部给药属中医外治法，也可归于现代医学的经皮给药系统（Transdermal Drug Delivery System，TTS）范畴［1］。人体脐部皮肤表皮角质层薄，屏障功能弱，皮下无脂肪组织，药物易渗透弥散，有利于吸收；且皮下血管丰富，渗透力强吸收迅速，门静脉、脐静脉、腹壁静脉与上下腔静脉形成通道，利于敷脐药物经过该侧支循环进入血液而发挥作用［2］。脐部给药可避免药物的首过效应，降低药物毒性和不良反应，维持稳定而持久的血药浓度，提高疗效，减少给药次数［3］。以丁香与肉桂为代表的温里药常用于脐部给药，起到温中散寒止痛的作用，如以丁香肉桂为主要药物的市售成方制剂丁桂儿脐贴，在治疗小儿腹痛腹泻中疗效卓著，受众极广。脐部给药方式虽有悠久应用历史，且临床疗效确凿，但目前对其现代机制的研究报道少见。

丁桂散由丁香、肉桂组成。方中的丁香具温中降逆、补肾助阳的功效；肉桂具补火助阳、引火归源、散寒止痛、活血通经的功效［4-5］。丁桂散对多种炎性水肿有明显的抑制作用，可明显缩短豚鼠伤口愈合时间，提高溶菌酶的活性，促进动物创面的白细胞、浆细胞浸润，毛细血管、胶原纤维增生［5］。丁香中提取的丁香挥发油，其主要成分为丁香酚［6］。丁香酚有解热、抗病原微生物、抗肿瘤、抗氧化作用［7-8］。肉桂中提取的挥发油，其主要成分为桂皮醛，体内吸收后被代谢为肉桂酸，具有利胆、抗炎、抗真菌、抗突变、抗氧化、抑制血小板聚集等作用［7，9］。本文中，以丁香酚与肉桂酸为丁桂散中有效成分的代表作为检测指标，研究丁桂散脐部给药的体内药动学特征。

1 实验材料与设备

1.1 药品与试剂

肉桂 （批号081107）、丁香 （批号080702）购于上海康桥中药饮片有限公司；肉桂酸（纯度＞98%，批号MUST-10040201）、丁香酚（纯度：98%，批号MUST-10040201）购于成都曼思特生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）购于默克股份两合公司，其余试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验动物

SD大鼠， （200±20）g/只，雌雄各半，SPF级，由上海中医药大学动物实验中心提供。动物合格证号：SCXK（沪）2015003。动物于恒温环境（24±2）℃饲养，自由饮食，适应环境1周后使用。

1.3 仪器

LC-2010A HT型高效液相色谱仪（日本岛津公司），CP225D型、BSA224S型电子天平（德国Sartorius公司），Vortex genius 3 S25型圆周振荡器（德国IKA公司），MiniSpin个人型高速离心机（德国Eppendorf AG公司），SB-3200D型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），TGL-16G-A型管式离心机 （上海安亭科学仪器厂），DC-12H型氮吹仪（上海安谱科学仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 丁桂散的制备

将丁香与肉桂分别粉碎后过80目筛，再以各等份（w/w）混合均匀，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；柱温：30°C；流速：1.0 mL/mol。丁香酚检测波长：280 nm；流动相：甲醇-水（60∶40）。肉桂酸检测波长：270 nm；流动相：甲醇-乙腈-水-乙酸（25∶26∶49∶0.3）。

2.3 对照品溶液与质控样品的配制

精密称取丁香酚与肉桂酸对照品适量，精密称定，分别以甲醇配制成1.04 mg/mL（丁香酚）和20.20μg/mL（肉桂酸）的对照品母液，由此来配制系列浓度的对照品供试液。

分别以空白血浆配制丁香酚对照品浓度分别为0.37、2.95、5.91、23.64、94.55μg/mL，和肉桂酸对照品浓度分别为0.20、0.40、0.59、0.78、0.96、1.84μg/mL的血浆样品，照2.4项下处理后检测，拟合血浆标准曲线。

质控样品的处理方法与血浆标准曲线样品处理方法相同，丁香酚质控样品中丁香酚对照品低、中、高浓度分别为：2.95、23.64、94.55μg/mL；肉桂酸质控样品中肉桂酸对照品低、中、高浓度分别为0.40、0.96、1.84μg/mL。

2.4 血样处理

取肝素抗凝血浆100μL于离心管中，精密加入1 mol/L的醋酸25μL，漩涡振荡30 s，分别加入氯仿0.4 mL和0.3mL萃取2次，每次漩涡振荡1 min，离心5 min（5 000 r/min），合并两次氯仿提取液，氮气吹干，残渣以50μL甲醇复溶，超声5 min，漩涡1 min，离心10 min，即得样品液。

2.5 体内药动学研究

参照国家药品监督管理局颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》 （【H】GPT5-1）开展正常大鼠与溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）模型大鼠的脐部给药药代动力学研究。将SD大鼠随机分成4组，分别为UC-脐部组、UC-旁开组、UC-灌胃组、正常-脐部组。其中UC组动物造模方式为：将大鼠禁食禁水24 h，腹腔注射3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，固定于鼠解剖台上，将一直径2.0 mm长约11 cm的橡胶输液管，由肛门轻缓插入深约8 cm，给予5%的2，4，6-三硝基苯磺酸（0.2 mL/100 g），再注射50%的乙醇溶液0.3-0.5 mL，缓缓注入到大鼠肠腔内，再注入少许空气，提起大鼠尾部，倒置1-2 min，使造模剂充分渗入［10］。为模拟中医寒症UC成因，于第2天置冰水浴中2 min，1次/d，共3次。记录大鼠每天的体重、进食量、饮水量、毛发光泽度、大便性状以及活动情况。脐部与旁开给药组给药前用5%水合氯醛麻醉，以电动剃须刀去除给药部位鼠毛，分别于神阙穴（以脐部为中心）和旁开部位给予丁桂散细粉0.1 g（0.1 mL米醋调成糊状）［11-12］，胶布固定，确保实验过程中胶布不脱落；灌胃组以1 mL温水稀释0.1 g丁桂散细粉，加入0.1 mL米醋，灌胃给药。给药后分别于0，10，30，60，120，180，240，360，480，720，1 440min从大鼠眼眶取血250μL，置于肝素化离心管中，离心5 min（离心力4 862×g，5 000 r/min）。所得血样按2.4项下方法处理。

2.6 数据统计分析

3 实验结果

3.1 方法学验证

丁香酚与肉桂酸的保留时间分别为13.00 min和9.80 min，血浆中内源性物质对色谱峰无明显干扰（图1），表明方法专属性良好。

图1 丁香酚与肉桂酸HPLC色谱图

分别以丁香酚和肉桂酸峰面积X对各自在血浆中的质量浓度Y进行线性回归，丁香酚与肉桂酸的回归方程分别为Y＝29089X－5022.7（r＝0.999 9）和Y＝0.001X+94.62（r＝0.999 8），表明丁香酚与肉桂酸分别在浓度为0.37μg/mL-94.55μg/mL和0.20μg/mL-0.96μg/mL范围内，与色谱峰面积呈良好的线性关系（图2）。丁香酚与肉桂酸最低定量限分别为0.37 μg/mL和0.20μg/mL，其信噪比均高于10。

图2 丁香酚（A）与肉桂酸（B）的浓度为因变量、峰面积为自变量的回归曲线

丁香酚与肉桂酸低、中、高浓度的准确度均在80%-120%之内，精密度均不高于20% （表1）。将质控样品依照2.4项下操作后，在室温下分别放置0、8、12、24、48、72 h进样检测，计算丁香酚与肉桂酸样品的低、中、高浓度RSD分别为3.01、6.34、6.05，和7.13、7.55、7.90；将质控样品在－20℃存放，反复冻融3次，处理后测定浓度，得丁香酚与肉桂酸样品的低、中、高浓度提取回收率 （%）分别为78.12±7.99、73.14±3.20、73.04±6.51，和84.95±9.01、81.86±4.78、104.71±4.08。以上结果符合2020年版《中国药典》（四部）“生物样品定量分析方法验证指导原则”相关规定。

表1 丁香酚与肉桂酸质控样品准确度（n＝3）和精密度（日内n＝6，日间n＝3）

表2 神阙穴、旁开、灌胃给药后丁香酚体内药代动力学参数 （n＝5）

3.2 体内药动学结果

各给药组血药浓度自达峰后均呈缓慢下降趋势，且有多峰现象，这可能由于散剂中药物成分的溶出速率不规律所致。取样终点的血药浓度均在峰浓度的1/3以上，表明给药24 h后，血中药物仍维持较高浓度，这可能由于散剂中药物溶出较慢，使吸收分布时间较长。灌胃给药组吸收较为迅速，且血药浓度维持在较高水平。UC模型组丁香酚血药浓度高于正常组（图3），但肉桂酸血药浓度在各经皮给药组中变化趋势相近（图4）。

图3 不同方式给予丁桂散后大鼠丁香酚血药浓度-时间曲线（n＝5）

图4 不同方式给予丁桂散后大鼠肉桂酸血药浓度-时间曲线（n＝5）

以非房室模型对血药浓度数值进行分析，所得药动学参数如表3和表4所示。与各经皮给药组相比，口服组吸收最快，两种所测成分的Tmax最小。口服组两种成分的Cmax最大，但与UC-脐部组相比无统计学差异（P＞0.05）。另外口服组肉桂酸AUC0→t在各组中最大，显著大于UC-脐部组（P＜0.05），丁香酚AUC0→t与UC-脐部组无显著差异（P＞0.05）。UC-脐部组两种成分的Tmax最大，但Cmax、AUC0→t与UC-旁开组相比无显著差异（P＞0.05）。另外，UC-脐部组丁香酚的Cmax、AUC0→t均显著高于正常-脐部组（P＜0.05），而该两组的肉桂酸的以上参数间无统计学差异（P＞0.05）。

表3 神阙穴、旁开、灌胃给药后肉桂酸体内药代动力学参数 （n＝5）

4 讨论

脐疗作为中医外治法为中医临床常用治疗方法之一，具有取材容易、操作简便、疗效显著等优点。神阙穴居脐中央，刺激此穴对五脏六腑具有调节作用。脐部给药为中医特色的给药方式，临床应用广泛，疗效确凿，且脐部给药产品众多，社会经济效益巨大，但目前对其作用机制的研究还较少。究其原因，主要是目前对经络穴位的研究尚不深入，对与人体相对应的实验动物穴位的确定尚缺乏统一标准。本文的结果，可为相关研究提供借鉴。

2020年版《中国药典》规定丁香饮片中丁香酚与肉桂饮片中桂皮醛含量分别不得低于11.0%和1.5%，丁香油与肉桂油中丁香酚和桂皮醛含量均不得低于75.0%，而丁香酚与桂皮醛均为挥发油类成分，极易经皮渗透，因此选择该两种成分评价丁桂散经皮给药具有代表性［13］。丁桂散中挥发油透皮速率快，因此采血时间定为给药后10 min即开始取样。考虑到采血对实验动物的影响，过长的取样时间会对实验动物的生理状况产生较大影响，继而干扰实验结果，另外临床每次脐部敷药时间一般不超过24 h，因此将采血终点设为24 h。

经皮给药与口服相比，表现出缓慢吸收的性能，但经皮给药组AUC0t与口服组相比差异并不大，提示挥发油易于经皮吸收，可以替代口服途径而提高患者依从性。而脐部给药与经皮给药组相比，在药物的体内药动学行为上未体现出特异性的吸收行为，提示脐部给药特异性的散寒止痛作用可能另有实现途径。另可能由于大鼠脐部疤痕结构较小，与旁开穴位皮肤结构相近或一致，因此以大鼠为模型动物进行脐部给药经皮吸收研究具有一定局限性。由于大鼠UC模型较之正常鼠体质瘦弱，皮下脂肪较少，而丁香酚与肉桂酸均为强脂溶性成分，经UC模型鼠皮肤吸收量大于正常鼠，AUC0t值高于正常鼠，该结果与本文作者的前期研究报道一致［14］。